本文是一篇临床医学论文，我们的研究发现，MAPK3基因在ESCC组织中的表达水平较低且与细胞增殖无关，MAPK3基因敲除后与ESCC的侵袭、转移相关，促进了细胞的侵袭、迁移，以及促进了小鼠体内ESCC远处转移能力。
第二章基于蛋白质组学筛选食管鳞癌中的差异蛋白及基因
2.1实验材料
2.1.1组织标本与石蜡切片
临床医学论文怎么写
（1）收集2019年5月至11月四川省人民医院胸外科接受手术的ESCC患者27对ESCC肿瘤组织及邻近非癌性食管组织，用于质谱分析。
（2）标本取自四川省人民医院病理科2018年食管癌患者术后石蜡切片共19对。
2.1.2实验试剂与实验耗材
（1）SDT裂解液（sigma，美国）（2）UA buffer（sigma，美国）（3）IAA buffer（sigma，美国）（4）TEAB溶液（sigma，美国）（5）0.1%甲酸溶液（sigma，美国）（6）0.1%甲酸乙氰溶液（sigma，美国）（7）一抗：兔抗人ERK1/2多克隆抗体（武汉三鹰，中国）（8）二抗：山羊抗兔IgG（HRP标记）(正能生物，中国）（9）浓缩型DAB试剂盒（中杉，中国）（10）辣根过氧化物酶（中杉，中国）（11）封闭三羊血清（索莱宝，中国）（12）3％H2O2（国产）（13）苏木素染色液（索莱宝，中国）（14）中性树胶（索莱宝，中国）（15）中性树脂（北京中杉金桥，中国）（16）组织冰冻切片OCT包埋剂（Leica，德国）（17）氯仿，异丙醇，无水乙醇（科隆，中国）
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2.2实验方法
2.2.1临床病理资料统计
统计ESCC组织与癌旁组织的临床病理数据，总共收集癌组织切片31张，癌旁组织切片21张。统计年龄、性别、肿瘤大小、TNM（T是原发灶，N是淋巴结，M是远处转移）分期及分化程度等临床资料。统计癌组织与癌旁组织的染色评分情况。收集ESCC患者27对人ESCC肿瘤组织及邻近非癌性食管组织。所有患者术前均未接受放疗、化疗或其他抗癌治疗。食管癌根治术后即刻取标本，液氮冷冻。食管癌的分期应根据目前美国癌症联合委员会(AJCC)公布的肿瘤淋巴结转移(TNM)分级所有标本的组织学特征均由病理学家根据WHO（世界卫生组织）标准进行评估。收集每个参与者的知情同意。本研究的所有方法均按照批准的指南进行，本研究获得四川省人民医院医学伦理委员会批准。
2.2.2质谱与生物信息学分析
（1）将IP（抗体蛋白）的样本上样到SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶上，电泳至溴酚蓝跑到分离胶下约0.5cm的位置。（2）用考马斯亮蓝染色10min左右。（3）用脱色液脱色直至蛋白条带可见为止。（4）将含有蛋白条带的胶块切下并切至1mm3左右大小，将切碎的凝胶转移到新的干净1.5ml离心管内。（5）加入1ml 50%乙醇，在3D摇床脱色，直至凝胶变为无色为止，每隔15分钟更换一次50%乙醇。（6）用超纯水洗胶块2次，每次洗10min。（7）在乙腈中洗胶块10min。（8）在真空离心浓缩仪中干燥凝胶。（9）加入适量能覆盖凝胶的10mM DTT溶液（1.5mg/ml，用25mM碳酸氢铵溶解），55℃摇动孵育1h，去除上清。（10）加入适量能覆盖凝胶的55mM碘乙酰胺（10mg/ml，25mM碳酸氢铵稀释），室温避光孵育45min，去除上清。
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第三章体外实验验证MAPK3在食管鳞癌中的作用
3.1实验材料
3.1.1实验试剂及耗材
（1）限制性核酸内切酶BamHI,BsmBI（cat.R0580L）,EcoRI（cat.R0101S）,XbalI（NEW ENGLAND BioLabs，美国）（2）T4 Ligase（cat.M0202L）（NEW ENGLAND BioLabs，美国）（3）T4 PNK（NEW ENGLAND BioLabs，美国）（4）核酸Maker DL2000（北京擎科，中国）（5）2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）DNA聚合酶（南京诺唯赞，中国）（6）Q5高保真DNA聚合酶（NEW ENGLAND BioLabs，美国）（7）质粒小提试剂盒（Plasmid Mini Kit I)（OMEGA Bio-tek，美国）（8）胶回收试剂盒（OMEGA Bio-tek，美国）（9）Cycle-Pure PCR纯化试剂盒（OMEGA Bio-tek，美国）（10）总RNA提取Trizol试剂（Invitrogen，美国）（11）糖原（Thermo Fisher，美国）（12）无内毒素质粒大提试剂盒（北京天根，中国）（13）DPBS磷酸盐缓冲液，DMEM培养基，DMEM/F12培养基，TrypLE消化液，0.25%胰酶（Gibco，美国）（14）酚氯仿异戊醇（25:24:1）溶液（生工，中国）（15）重组鼠EGF，重组人FGF10，Y27632,，A8301，Noggin，Rspondin等细胞因子（PeproTech，美国）（16）荧光素酶底物（Biosharp，中国）（17）ARID1A兔单抗（#12354）（Cell Signaling Technology，美国）（18）E-Cadherin兔单抗（#3195）（Cell Signaling Technology，美国）（19）阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色试剂盒（索莱宝，中国）（20）ATAC-seq，Cut&tag CHIP-seq建库试剂盒（上海近岸蛋白质，中国）（21）二甲基亚砜(DMSO)（MP Biomedicals，美国）（22）Rnase/DNase-free H2O（凯杰生物，中国）（23）SYBR Green（诺唯赞(Vazyme Q711)，中国）（24）固相RNase清除剂（索莱宝，中国）（25）1M HEPES缓冲液，GlutaMax Supplement,Pen Strep双抗（Gibco，美国）
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3.2实验方法3.2.1构建含有目的基因single guide RNA的V2TC质粒
3.2.1.1设计目的基因的single guide RNA
1）在NCBI网站中搜索种属为人的目的基因，获取目的基因第一外显子序列ATG开始后的200bp左右长度，输入https://www.atum.bio/catalog/vectors/grna-design网站，计算机会自动设计出多条靶向该基因的single guide RNA，选择评分靠前的single guide RNA；
2）将选出的single guide RNA序列输入Ensemble网站的BLAST中，查找相似序列，预防single guide RNA脱靶事件的发生，排除有严重脱靶倾向的singleguide RNA，最后每个基因选出至少两条single guide RNA；
3）根据Cas9蛋白的工作原理，将选出的single guide RNA序列第一个碱基替换成G，并在F链3’端加上连接接头CACC碱基序列，R链5’端加上AAAC，设计完成的引物导入excel表格中发送至公司进行合成。
3.2.1.2构建single guide RNA载体质粒
本实验室用于连接single guide RNA的载体V2TC质粒是由张峰实验室构建的第二代带有Cas9序列的质粒V2T的基础上，使用Xba1I与BamHI双酶切，用报告基因mC herry序列取代spCas9蛋白表达序列构建而成，所以后续实验过程中，可根据荧光强弱判断single guide RNA感染效率。
1）双酶切V2T质粒
A.配置酶切反应体系：
临床医学论文参考
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第三章体外实验验证MAPK3在食管鳞癌中的作用.....................................18
3.1实验材料·································18
3.1.1实验试剂及耗材·····························18
3.1.2主要仪器设备·······························19
第四章MAPK3在食管鳞癌移植瘤小鼠模型中的作用..............................................41
4.1实验材料······························41
4.1.1实验试剂及耗材···························41
4.1.2主要仪器设备···························41
第五章讨论............................55
第五章讨论
我国ESCC约占每年新发食管癌的90%[23]。食管癌已被证明最难治疗的恶性肿瘤之一，手术治疗目前仍只对早期预后有益[24]。由于治疗相关的死亡率较高，晚期患者食管癌切除术结合放化疗的总生存期无差异或差异较小[25]。因此，研究食管癌转移相关机制，进一步提高食管癌患者总生存率。研究表明，蛋白质组学在肿瘤中的应用越来越广泛，MAPK3基因编码的蛋白质是MAP激酶家族的成员。MAP激酶，也被称为细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulatedkinase,ERK），在信号级联中发挥作用，调节各种细胞过程，如增殖、分化和细胞周期进程，以响应各种细胞外信号。该激酶被上游激酶激活，导致其转位到细胞核，并磷酸化核靶。ERK的表达对肿瘤的发展至关重要，其过度活化在肿瘤的发展和进展中起着重要作用。RAS/MAPK/ERK通路是所有MAPK信号转导通路中最重要的信号级联，ERK通路中上游蛋白和激酶的过度激活已被证明会诱发各种疾病，其中包括癌症的发生[26]。MAPK通路在细胞增殖、分化、凋亡、血管生成和肿瘤转移等方面发挥着比其他通路更为重要的作用[27]。研究表明，ERK与多种癌症有关，包括乳腺癌、肝细胞癌、肺癌和结直肠癌[28]。MAPK3基因过表达后调控乳腺癌细胞的肿瘤抑制作用[29]，ERK1/2的表达水平与口腔鳞癌的侵袭和转移具有相关性[30]。同样的，有相关研究证实在ESCC中通过细胞外信号调节激酶信号通路促进细胞凋亡和抑制转移[31]，进而抑制细胞增殖、克隆原性、细胞活力和肿瘤形成。由于食管癌的发生不仅与环境因素、生活习惯、微生物等外部因素有关，还与遗传因素和基因表达差异密切相关[32-35]。有研究报道，通过调控MAPK3基因的表达水平，对肿瘤的增殖和远处转移具有重要的影响[36]。综上表明，我们认为MAPK3基因可能与ESCC的侵袭转移机制相关，在ESCC的远处转移中发挥重要的作用。目前我们通过免疫组化检测、细胞功能验证等体外实验，ESCC小鼠模型的构建、小鼠成瘤等体内实验研究MAPK3基因在ESCC中的功能作用，分析推测可能参与的转移机制的信号通路。
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第六章总结与展望
6.1总结
由于极具侵袭性而出现远处转移和较低的远期生存率，ESCC是世界上最为致命的癌症之一，在我国患病人群位居前列。因影响肿瘤进展的关键原因是转移灶的形成，由于早期检测缺乏有效的生物标志物，目前手术治疗后患者的生存率仍不高，预后差。基于蛋白组学筛选出关键基因在肿瘤中被广泛研究。本研究通过以下两方面进行总结：
第一，细胞与类器官培养。本文通过详尽的篇幅综述了基于蛋白组学在肿瘤中的背景介绍，在收集ESCC的临床标本后基于蛋白质组学筛选出关键基因MAPK3。首先通过免疫组织化学实验研究了MAPK3基因在ESCC组织中表达水平下调，为了进一步研究其细胞功能的作用，构建了MAPK3基因敲除细胞组。MAPK3基因敲除对细胞、类器官增殖无影响，在类器官培养中形态学表现出延伸突触表型，MAPK3基因敲除后显著促进ESCC的侵袭、迁移。
第二，裸鼠成瘤与病理。根据细胞与类器官相关实验结果推测MAPK3基因可能参与ESCC转移调控。接下来通过构建ESCC小鼠模型，与对照组相比，MAPK3基因敲除的小鼠体内出现多处肿瘤转移灶，如腹腔淋巴结、肾脏、肝脏及肺等。MAPK3基因的敲除促进了小鼠体内ESCC的成瘤和转移能力，肿瘤在病理上分化程度变差。
综上所述，我们的研究发现，MAPK3基因在ESCC组织中的表达水平较低且与细胞增殖无关，MAPK3基因敲除后与ESCC的侵袭、转移相关，促进了细胞的侵袭、迁移，以及促进了小鼠体内ESCC远处转移能力。MAPK3基因作为信号调节激酶，可能在经典Ras/MAPK细胞信号转导通路激活或失活调控底物蛋白表达参与ESCC的EMT进程从而在ESCC的转移中发挥重要作用，有待进一步实验研究。
参考文献（略）