本文是一篇临床医学论文，本研究下载了TCGA 的 RCC 患者的转录组数据并进行 JAK-STAT 通路关键分子与 EPSTI1的相关性分析，发现 JAK-STAT 信号通路中的部分关键分子的表达与 EPSTI1的表达呈正相关，这也支持了 PPI 分析的结果。因此，本研究猜想 EPSTI1 影响 RCC 的生物学行为的过程可能与 JAK-STAT 信号传导通路有关，当然，这一猜想需要进一步实验验证。
前言
肾癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，占成人所有恶性肿瘤的 2%-3%，其中尤以肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）为主，占全部肾癌的 85%[1]。最新统计数据显示，全球每年肾癌的新发病例约 40.3 万，而因其致死病例约达 17.5 万[2]。在我国，肾癌发病率在恶性肿瘤死亡率排名第 19 位，呈逐渐上升趋势[3,4]，男性总体发病率高于女性，是仅次于膀胱癌的泌尿系肿瘤，已经严重到威胁人类的健康[5]。肾癌由于早期没有明显典型的症状，故早期诊断较为困难，既往的肾癌三联征（血尿、腰痛、腹部肿块）出现率不足 20%，据统计约 30%的患者在确诊时已经出现肿瘤的远处转移[6-8]。临床上针对肾癌的治疗，手术切除仍然是主要治疗手段，局限性肾癌可采用根治性肾切除术或保留肾单位手术，但晚期的转移性肾癌，术后往往需要辅以靶向治疗或免疫治疗[9]。
目前研究认为肾癌的发病机制与希佩尔-林道抑癌基因的 Von Hippel Lindau（VHL 3p25-26）基因的突变关系密切[10]。VHL 基因是 1993 年由 Latif等人鉴定，对该基因的命名源于对遗传性希－林氏综合症的研究[11]。肾癌在VHL 病中的发生率高达 28%-45%，遗传性希－林氏综合症患者普遍携带生殖系缺陷的等位基因，受累器官的另一等位基因则在个体出生后经体细胞突变而丧失功能，临床上大约有 2%的肾癌患者与其直接相关[12]。目前研究发现在所有散发性的肾透明细胞癌中约 80%VHL 基因存在突变，另外甲基化导致 VHL基因的沉默发生在 5%-30%的病例中[13]。VHL 基因编码的 E3 泛素连接酶蛋白，是 VHL 复合体的组成部分，E3 泛素连接酶蛋白的作用是对下游靶蛋白进行泛素化，从而促进下游靶蛋白的降解。低氧诱导因子 HIF-1α（Hypoxia-inducible factor）是 E3 泛素连接酶复合体的下游靶蛋白之一，HIF-1α 的降解受其调控[14]，在正常情况下 HIF-1α 在胞内保持稳态。HIF-1α 是一个转录因子，在缺氧环境下能识别缺氧反应原件（HRE）并启动下游靶基因（包括血管内皮生长因子（VEGF）、血小板源生长因子（PDGF）转化生长因子 α 等）的转录[15]，促进血管新生。
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资料与方法
2.1 数据搜集和预处理
本研究从公共数据库 GEO 数据库下载转录组芯片 GSE76068、GSE64052进行。GSE76068 包含舒尼替尼敏感及舒尼替尼耐药 786-0 细胞样本各 13 例；GSE64052 包含舒尼替尼敏感及舒尼替尼耐药 786-0 细胞样本各 16 例；同时满足|logFC|≥1.2 及 adjust P <0.05 的基因初步筛选为候选基因。最后将 2 个芯片结果取交集的结果作为候选基因。
2.1.1 在线数据库验证并确定目标基因
GEPIA 数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)收录了 TCGA 和 GTEx 数据库的肿瘤和正常样品进行基因表达谱信息。利用该网站可以获得目的基因在肿瘤中与相应正常组织中的表达情况、生存差异以及与其密切相关的其他关键基因等[25]。
人类蛋白质表达图谱( Human protein atlas，HPA)是利用转录组学和蛋白质组学技术，从 RNA 和蛋白水平研究人类不同组织和器官中的基因表达情况的数据库(https://www.proteinatlas.org/)[26] 。其中病理图谱基于使用 8000 名患者的数据对 17 种主要癌症类型的转录组进行系统分析，以描述 RNA 和蛋白质水平对临床生存的影响[27]，用该数据库获得目标基因在蛋白表达水平的情况并结合查阅文献的结果选定最后的目标基因。
2.1.2 目标基因的 PPI 网络构建及 GO、KEGG 分析
将筛选出的目标基因导入 String 数据库(https://string-db.org/)构建候选基因的相关蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络图[28]，将PPI 文件导入软件 Cytoscape[29]中，利用 MCODE 插件计算 PPI 网络中每个节点的中心度(degree)、接近中心度(closeness)和中介中心度(between)，并将各蛋白节点的 degree 均值定义为该 PPI 网络节点的阈值，筛选 degree 值大于阈值的蛋白，得到 PPI 关键节点。
临床医学论文参考
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2.2 实验验证
2.2.1 RCC 组织样本的选择
本研究选择了 2020 年 6 月至 2020 年 12 月在福建医科大学附属第一医院接受手术切除的 4 例 RCC 患者获取肿瘤标本和配对癌旁标本，平均年龄为 65.1（51-75）岁，美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）临床分期分布为：I 期 1 例，II 期 2 例，III 期 1 例。获取新鲜标本后立即保存于-80℃液氮中备用。所有纳入病例均获得患者知情同意。
2.2.2 细胞株及实验材料
人肾癌细胞系 786-0，由本科实验室留存，在含有 10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）和 1%青霉素/链霉素（invitrogen, Carlsbad, CA, USA）的DMEM 培养基中进行培养。
2.2.3 细胞系与细胞培养
人肾癌 786-0 细胞株以含 10%FCS 的高糖 DMEM 培养液，在 37℃、5%C02及饱和湿度条件下进行常规培养，用 0.25%胰酶消化处理对数生长期的人肾癌细胞株细胞，24h 换液，当细胞呈单层致密状分布时，用 PBS 冲洗，0.25%胰蛋白酶消化后以 1：3 传代，取对数生长期的细胞进行实验。
本研究通过转染 EPSTI1 干扰序列 siRNA-EPSTI1，构建 786-0-si-EPSTI1细胞株。转染前取对数生长期细胞用 DMEM 培养，待细胞达 80%～95%融合时分组转染：实验对照组(786-0+si-NC)和实验组(786-0+si-EPSTI1)。严格按LipofectamineTM 2000 试剂说明书进行操作。
2.2.2.1 细胞培养与传代：
(1)操作前，75%酒精擦洗超净台，将培养基、移液枪、PBS 等所需物品放置超净台内，再以紫外灯照射 30min；
(2)弃去培养皿中旧培养基，加入 PBS 2mL，轻轻摇晃培养皿，清洗细胞表面后弃去，再重复洗一次；
(3)加入 0.25%胰蛋白酶 1mL，使其覆盖培养皿中细胞表面，置于 37℃细胞培养箱中消化 2～3min，显微镜下观察当细胞回缩，间隙加大并有细胞脱离时加入含血清培养基 1.5mL；
(4)用移液枪轻柔吹打贴壁细胞，将培养皿中液体转移至 10ml 离心管，配平后 1000r/min 离心 5min；
(5)弃掉离心管中上清液，加入 3ml 培养基，轻柔吹打混匀（尽量不要产生泡沫），按 1:2 比例传代，置于培养箱继续培养，并根据细胞生长状态换液、传代，标注好日期、细胞名称。
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结果 .................................... 18
3.1 初筛差异表达基因 .......................................... 18
3.2 在线数据库验证目标基因在肾癌中高表达 ............................... 20
3.3 构建 EPSTI1 的 PPI 网络及 GO 分析、KEGG 分析 .................................. 20
3.4 EPSTI1 与肾癌患者的临床特征及预后分析 ............................. 23
讨论 ...................................... 29
结论 ......................... 32
讨论
肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是发病率仅次于膀胱癌的泌尿系统肿瘤，起病较隐匿，大约有三分之一的患者确诊时已出现肿瘤的转移，这些患者的 5 年生存率不足 10%，特别是晚期肾癌尚缺乏疗效较好的治疗手段[32]。手术是治疗早期肾癌的主要方法，晚期 RCC 患者的传统治疗手段包括放、化疗及以白介素-2、干扰素等治疗手段。TKI 药物的出现为晚期 RCC 的治疗翻开了新的篇章。舒尼替尼是目前国内临床一线的 TKI 药物，尽管 TKI 药物能过显著缩短肿瘤体积并延长晚期肾癌患者中位无进展生存期，却不能保持持久疗效，多数患者会在治疗开始的 5-10 月出现耐药，进而引起肿瘤进展[33]。因此，关于肾癌耐药的形成机制成为领域的研究重点。
舒尼替尼是第一代多靶点 TKI 类药物，它可以非公价竞争性结合多种酪氨酸激酶受体，抑制其磷酸化。在人类肿瘤小鼠移植模型中，舒尼替尼具有降低血管通透性、抑制新生血管形成、破坏已生成的肿瘤血管作用[34]。尽管 TKI药物的应用给肾癌患者带来很大的福音，使得肾癌患者在预后方面有了一定的改善，但随着药物的应用，耐药逐渐降低了靶向药物的临床效果。约有 20%左右的患者在初次服用舒尼替尼时即会表现出对药物的先天耐药，而大部分患者在使用舒尼替尼治疗 6-11 个月后便会出现对药物的继发耐药[35]。
舒尼替尼的原发性耐药和继发性耐药的机制尚未明晰，根据已有报道，耐药机制大致可分为：促血管生成信号通路活化、肿瘤微环境改变、肿瘤侵袭转移能力增加、micro RNAs 的作用以及介导其他信号旁路的激活[35]。促血管生成因子，例如 Ang2、FGF、PDGF，在大多数舒尼替尼耐药的病例中上调表达[36]。事实上，抗血管生成导致的缺氧可以激活 mTOR 信号通路，促进 HIF 生成，激活含有 HRE 的基因转录，这些基因包括 VEGF、PDGF、TGF-α、EGFR、HGFR/c MET 及 CXCR4。此外，肿瘤微环境改变在肾癌舒尼替尼继发性耐药中的关键作用也已得到证实[37]。有研究强调了周细胞在肾癌舒尼替尼耐药的作用，周细胞在抑制 VEGF 后生长并覆盖内皮细胞[38]。目前有关肾癌舒尼替尼耐药相关的分子标志物研究较少，故肾癌的舒尼替尼耐药问题逐渐成为一个研究热点和重点。
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结论
总之，生信分析提示 EPSTI1 在 RCC 舒尼替尼耐药组织样本及 RCC 组织中均存在高表达，并且 EPSTI1 高表达是 RCC 患者不良预后的独立危险因素，实验证实，敲低 EPSTI1 表达后，786-0 细胞的侵袭能力减弱、对舒尼替尼耐药性明显缓解，其具体分子机制还有待进一步研究，EPSTI1 未来或可作为肾癌治疗的新靶点。
参考文献（略）