引 言
前列腺癌是男性泌尿系统常见的肿瘤，多数前列腺癌患者在首次接受雄激素剥夺疗法后有显著疗效，然而多数情况下在应用一段时间后雄激素非依赖型细胞比例上升，并最终由雄激素依赖型前列腺癌（Androgen-dependent Prostate Cancer，ADPC）发展成为高度恶化且广泛转移的雄激素非依赖型前列腺癌（Androgen-independent Prostate Cancer，AIPC）。目前还没有特别有效的方法来治疗 AIPC，成为临床最棘手的问题。同时前列腺癌细胞受到多种参与细胞凋亡与细胞增殖的众多分子的调控，内稳态的打破最终导致细胞凋亡与增殖控制的异常，深入研究前列腺癌发生发展进程中复杂的调控机制和雄激素依赖状态演变的分子机制，这为前列腺癌患者提供新的有效的治疗策略是非常重要的[1-2]。核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）家族在哺乳动物中包括 RelA、NF- B1/p50、RelB、NF- B2/p52 和 c-Rel 等成员，在免疫反应、炎症发生、肿瘤形成和淋巴细胞发育等多种生物学过程中发挥非常重要的作用[3-4]。在静止细胞中，NF-κB与 NF-κB 抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）结合而被锁定在细胞浆中处于非活化状态。有两条主要的信号转导通路可活化 NF-κB 二聚体，其中经典性 NF-κB 信号通路主要活化 RelA/p50 二聚体，非经典性 NF-κB 信号转导通路主要活化 RelB/p52 二聚体。非经典 NF-κB 信号通路可以被一系列特异性刺激物所激活，如 ltα1β2，B 细胞活化因子（B-cell-activating factor，BAFF）和 CD40 等等，在外周淋巴器官发育和 B 淋巴细胞发育中发挥至关重要的作用[5]。
异常调节的 NF- B 活性是多种实体瘤以及血液系统恶性肿瘤疾患的标志并影响者疾病的进程，靶向 NF- B 活性的治疗策略尤其是蛋白酶体抑制剂硼替唑米（Bortezomib）的临床应用也因此备受瞩目[6-7]。随着以 p52/RelB 异源二聚体活化为特征的“非经典性 NF- B 信号转导通路”的成功发现及功能的深入，对其在肿瘤中的作用也逐渐引起了重视。代表着非经典通路活性的 RelB 蛋白，越来越多地被证实与实体瘤的发生发展相关，包括乳腺癌和前列腺癌等等[8]。在 NF-κB 家族成员中，RelB在前列腺癌组织中的表达最为常见，并且其表达水平与前列腺癌 Gleason 评分直接相关，表明 RelB 参与前列腺癌的发生发展进程并可能与前列腺癌预后存在相关性[9-10]。近期研究表明，RelB 在体内参与了前列腺的癌变过程，提示 NF-κB 非经典通路在前列腺癌进程中的作用[11-12]。值得重视的是，IKKα 通过下调抑制基因乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂（mammaryserpin，Maspin）的表达而介导前列腺癌细胞转移，预示以 p52/RelB 二聚体活化为特征的非经典性 NF- B 信号转导通路不仅在前列腺癌发生并且转移过程中起重要作用[13-14]。本课题组前期研究发现 RelB 在雄激素非依赖型前列腺癌细胞株中呈持续活化，在雄激素非依赖性前列腺癌细胞株和晚期前列腺癌组织中，Maspin 与 RelB 的表达呈负相关性。蛋白酶体抑制剂能诱导 DU145 细胞中 Maspin 表达上调并伴随 RelB 的表达下调。RelB蛋白的表达对于蛋白酶体抑制剂诱导的Maspin表达上调是必要的，RelB负性调控抑癌基因 maspin 的表达，进而影响了前列腺癌细胞的生物学行为[15-17]。而maspin 被认为是一种抑癌基因，研究报道 Maspin 通过对丝氨酸蛋白酶的抑制，诱导肿瘤细胞与细胞外质的粘附而抑制肿瘤细胞的侵袭[18]，所以 RelB 与 Maspin 之间有着非常重要的联系，并且 RelB 对前列腺癌在侵袭方面也可能有着一定的作用。在侵袭性前列腺癌细胞中，RelB 起到辐照保护的作用，该效应部分通过诱导抗氧化和抗凋亡的锰超氧化物歧化酶（manganese superoxid dismutase ，MnSOD）而作用[19]。MnSOD 是线粒体基质中一种关键的抗氧化酶，对肿瘤细胞的辐射耐受非常重要，影响细胞周期和凋亡因子的表达。RelB 失活后可抑制 MnSOD 的表达，增强前列腺癌细胞对辐射的敏感性。1，25-二羟维生素 D3可以通过抑制 RelB 表达而下调 MnSOD的表达，起到了增强前列腺癌细胞放疗敏感性的作用。靶向 RelB 的治疗策略近年来用于克服前列腺癌的辐照耐受[20-21]。
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材料与方法
1 材料
1.1 细胞株、载体和菌株：
人前列腺癌细胞株 DU145（雄激素非依赖型），PC-3（雄激素非依赖型），LnCap（雄激素依赖型），此为我实验室长期保存。 质粒 PSilencer3.1-H1-neo（结构见图 1）购自 Ambio 公司，克隆用 E.coli TOP 10 菌株此为我实验室长期保存。
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1.2 主要试剂：
RPMI 1640： GIBCO BRL 公司
胎牛血清（FCS）： 杭州四季青公司
RelA 抗体（sc-8008）： Santa Cruz Biotechnology 公司
RelB 抗体（sc-22）： Santa Cruz Biotechnology 公司
p100/p52 抗体（sc-298）： Santa Cruz Biotechnology 公司
p105/p50 抗体（sc-7178）： Santa Cruz Biotechnology 公司
β-actin 抗体（AA128）： 碧云天公司
Matrigel： BD 公司TEMED： 广州展晨生物科技公司
siRNA： Santa Cruz Biotechnology 公司
转染试剂 Lipofectmine2000 ： Invitrogen 公司
限制性内切酶 HpaI 和 Xhol： NEB 公司
质粒小抽和大抽试剂盒： OMEGA 公司
胶回收试剂盒： OMEGA 公司
BamHI、HindIII： Fermentas 公司
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2 方法
2.1 细胞的培养培养
基用含 10%胎牛血清、100U/ml 青霉素和 100μg/ml 链霉素的 RPMI 1640，在 37oC、5%CO2和饱和湿度的培养箱中进行培养。应用倒置显微镜观察细胞生长情况，2～3d 可传代 1 次，选用对数生长期细胞进行实验。
2.2 质粒的构建与细胞建株
2.2.1 RelB-shRNA 的设计和表达载体的构建
2.2.1.1 设计 RelB 基因的 RNA 干扰片段：按照 shRNA 序列设计原则，利用Dharmacon RNAi Technologies 设计针对人的 RelB 基因的 RNA 干扰片段，RelB 基因序列为第 275-293 位点(5 -GCACAGATGAATTGGAGAT-3 )。根据已选定的干扰靶点设计 shRNADNA 的正义链和反义链，并交由 Invitrogen 公司合成。
2.2.1.2 退火复性：将 Invitrogen 公司合成的 shRNA DNA 的正义链和反义链溶于ddH2O，并进行退火复性反应，反应体系如下，将反应混合液放置 95oC，5 分钟，然后关闭加热器自然冷却至室温，形成浓度为 100ng/μl 的双链 DNA 干扰片段。-20oC保存备用。
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结 果....14
讨 论....26
参考文献.......30
综 述....34
讨 论
本课题旨在探讨核转录因子 RelB 在前列腺癌中的作用，研究发现 RelB 和 p52在 DU145 和 PC-3 细胞中呈不同程度的上调，但以 DU145 细胞中 RelB 的蛋白表达最为显著。RelB 的缺失显著抑制了前列腺癌细胞株 DU145 细胞的生长，与细胞凋亡增多相关，bcl-2 基因的下调可能是潜在的原因之一。RelB 缺失显著抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，ITGB1 基因表达的下调以及 MMP2 和 MMP9 活力的减弱是潜在的原因之一。前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病随年龄而增长，其发病率有明显地区差异，欧美地区较高，亚洲地区发病率较低。其发病原因尚未完全阐明，可能与环境及遗传因素有关[23]。核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）家族在哺乳动物中包括 RelA、NF- B1/p50、RelB、NF- B2/p52 和 c-Rel 等成员，在免疫反应、炎症发生、肿瘤形成和淋巴细胞发育等多种生物学过程中发挥非常重要的作用。经典性 NF-κB 信号通路主要活化 RelA/p50 二聚体，非经典性 NF-κB 信号转导通路主要活化 RelB/p52 二聚体。代表着非经典通路活性的 RelB 蛋白，越来越多地被证实与实体瘤的发生发展相关，包括乳腺癌和前列腺癌等等。Xu Y 等[12]是最先报道出 RelB与前列腺癌的生长呈正相关性的，利用体内外实验均证明了肿瘤细胞内 RelB 的高表达与前列腺癌的成瘤性成正相关性，但未探讨说明其内在的调控机制。Lee DW 等[24]也报道了 RelB 可以增加脑胶质母细胞瘤成瘤的作用。我们通过利用 xCelligence 系统实时动态观察对比研究对照组和实验组细胞株的生长曲线情况，结果也证明了 RelB的低表达可以抑制前列腺癌的生长速度。
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结论
为了进一步研究前列腺癌细胞在侵袭上的作用，用 xCELLigence 系统动态观察细胞生长 24 小时，发现 DU145-control 细胞的侵袭能力明显强于 DU145-siRelB 细胞。通过明胶酶谱 MMP 活性检测法检测 DU145-control 和 DU145-siRelB 细胞的 MMP 表达水平，实验结果显示 DU145-siRelB 细胞 MMP2 和 MMP9 的表达水平均明显低于对照组，同时用 Western blot 法检测 DU145-control 和 DU145-siRelB 细胞的 MMP2和 MMP9 蛋白表达水平，得到了与胶酶谱 MMP 活性检测实验一致的结果。MMPs是一种基质金属蛋白酶，可以降解各种胞外基质蛋白，也可以处理多种生物活性分子，参与细胞增殖、肿瘤细胞迁移侵袭、细胞分化、血管生成、细胞凋亡和宿主防御等生物过程[37]。MorozA 等[38]通过利用明胶酶谱 MMP 活性检测方法研究报道了非那雄胺通过下调 MMP2 和 MMP9 的表达从而抑制前列腺癌的侵袭。另最新的一项研究[39]表明 IL-6 通过上调 MMP2 和 MMP9 的表达从而促进鼻咽癌的侵袭和转移。上述研究结果均表明 MMP2 和 MMP9 的表达与肿瘤的侵袭是密切相关的，而我们的实验结果也表明DU145-siRelB细胞的侵袭能力显著弱于DU145-control细胞的潜在机制可能是因为 RelB 沉默后通过下调 MMP2 和 MMP9 的表达从而抑制了前列腺癌细胞的侵袭能力。
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参考文献（略）