前言
研究现状、成果
随着慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)病程的延长及病情的进展，一些患者将进入终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)。终末期肾病引发的水、电解质代谢紊乱，心血管事件，消化道出血，中枢神经系统障碍是患者急诊就医的常见原因。近年来，CKD 的患病率呈明显上升的趋势，在过去的几十年中，随着肾小球肾炎的积极治疗，肥胖和糖尿病的患病率迅速增加，糖尿病肾病已成为发达国家 ESRD 的最常见原因。根据美国肾脏数据系统统计，糖尿病肾病约占 ESRD 的 45%[1]。虽然通过降糖及降压治疗，糖尿病肾病仍不能获得良好的治疗效果，深入了解其致病机制并在此基础上加以应对成为治疗糖尿病肾病的突破口。糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症，病理机制复杂，遗传学和环境因素共同参与了糖尿病肾病的发病机制。目前认为，氧化应激、糖基化终末产物(advanced glycation end product,AGE)、炎症细胞因子、生长因子等都参与了该疾病的发生与发展，最终导致细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的增生，肾小球基底膜增厚，形成糖尿病肾病[2]。随着对其发病机制的研究深入，发现炎症反应在其中扮演重要角色，因此推测糖尿病肾病是一种慢性低水平炎症状态的疾病[3]。脂肪细胞因子将糖尿病、胰岛素抵抗与慢性低水平炎症之间存在着的必然的联系关联起来[4]，有助于更深入研究糖尿病肾病的发病机理。chemerin 就是新近发现的一种脂肪细胞因子[5]，与炎症密切相关，与炎症因子相互促进表达[6][7]，最终引起局部炎症反应的放大。我们推测 chemerin 可能通过促进炎症反应，从而导致糖尿病肾病的发生发展。
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研究目的、方法
本实验通过研究相关因子在大鼠肾脏系膜细胞及糖尿病肾功能不全大鼠模型中的表达，探讨chemerin对TGF-β1/Smads/CTGF信号通路及炎症因子的影响，阐明其在糖尿病肾病肾功能不全发病中的作用机制；同时分析肾功能衰竭患者临床生化指标，探讨血清 chemerin 与肾功能衰竭患者的相关关系。研究方法:1、根据 gene bank 合成大鼠 chemerin 基因序列，在两端添加 Hind III 和 BamH I的酶切位点，对 pcDNA 3.1(+)表达载体和 chemerin 全长同时进行双酶切后进行连接，成功构建 chemerin 表达载体。筛选阳性克隆，进行鉴定。2、研究以大鼠肾脏系膜细胞为研究对象，随机分为对照组、低糖组、高糖组、chemerin 组、联合干预组。利用构建的 chemerin 表达载体，转染系膜细胞，应用Real-time PCR方法检测TGF-β1/Smads/CTGF信号通路mRNA水平，用westernblot 法检测 TGF-β1/Smads/CTGF 信号通路蛋白表达情况，并进行半定量分析；使用 ELISA 法测定炎症因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白介素(interleukin,IL)-1 的水平，探讨体外试验条件下 chemerin 对于炎症因子、TGF-β1/Smads/CTGF 信号通路的影响。3、构建糖尿病肾功能不全(diabetic renal insufficiency,DRI)大鼠模型，以 DRI 大鼠为研究对象，分成正常对照组、生理盐水组、DRI 组、chemerin 组、联合干预组。利用构建的 chemerin 表达载体，注入大鼠肾脏，应用 Real-time PCR 方法检测 TGF-β1/Smads/CTGF 信 号 通 路 mRNA 水 平 , 用 western blot 法 检 测TGF-β1/Smads/CTGF 信号通路蛋白表达情况，并进行半定量分析；同时使用ELISA 法测定炎症因子 TNF-α、IL-1 的水平，探讨体内试验中 chemerin 对于炎症因子、TGF-β1/Smads/CTGF 信号通路的影响。4、ELISA 法检测人血清 chemerin 水平，分析与肾功能衰竭患者临床生化指标的相关性，揭示 chemerin 与肾功能衰竭患者的联系。
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一、构建 chemerin 表达载体
（pcDNA 3.1(+)-chemerin）chemerin 是新近发现的一种脂肪细胞因子，是 G 蛋白偶联受体——趋化因子受体 1 (chemokine-like receptor 1,CMKLR1 或 ChemR23)的配体[5]，主要由白色脂肪分泌，不仅能够调节脂肪细胞分化，还调控糖脂代谢相关的基因。chemerin水平不仅与肥胖[11]、代谢综合征[12]、糖尿病[13]、冠心病[14]相关，更有研究发现其在糖尿病肾病的发病中起重要作用[9]，然而具体的机制尚待阐明。所以我们通过构建 chemerin 真核表达质粒，研究 chemerin 的致病机制，为将 chemerin 靶向药物应用于糖尿病肾病患者的早期治疗提供理论依据。
1.1 对象和方法
1.1.1 主要试剂
(1)PCR 相关试剂溴化乙锭（ethidium bromide, EB）：Sigma 公司。三羟甲基氨基甲烷（Tris hydroxymethyl aminomethane, Tris）：Promega 公司。琼脂糖：上海英骏生物有限公司（Invitrogen）普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒：北京 TIANGEN 生化科技公司DNAmarker：大连 TaKaRa 生物技术公司2×Taq Plus PCR MasterMix ：北京 TIANGEN 生化科技公司。溶液组成：0.1 U Taq Plus Polymerase/μl；500μm dNTP Mixture；20mM Tris-HCl；100mM KCl；3mM MgCl2。
(2)重组质粒相关试剂pcDNA 3.1(+)：上海英骏生物有限公司（Invitrogen）T4 DNA 连接酶、限制性内切酶 Hind III 和 BamH I：大连 TaKaRa 生物技术公司RNA 酶 A(RNaseA)：大连生物技术 TaKaRa 公司DH5a 感受态细胞：北京 TIANGEN 生化科技有限公司质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒：北京 TIANGEN 生化科技公司蛋白胨、酵母提取物、琼脂、氨苄青霉素：上海生工生物工程有限公司.
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1.2 结果
1.2.1 pcDNA 3.1(+)-chemerin 重组体菌落 PCR 鉴定
目的基因 chemerin 与 pcDNA 3.1(+)分别经限制性内切酶 Hind III 和 BamHI 双酶切后连接后，转化感受态细胞，从 Amp 筛选 LB 平板中随机挑取阳性克隆作为模板进行 PCR 扩增，样品在 DNA marker 小于 200bp 处扩增出特异性条带,结果与预期片段大小相符，见图 1.1。chemerin 是新近发现的一种脂肪细胞因子，又名他扎罗汀诱导基因 2 或视黄酸受体反应蛋白 2，主要由白色脂肪组织分泌。人类 chemerin 基因定位于 7q36.1，含５个内含子和６个外显子，其 mRNA 长度为 734bp，起始合成蛋白质preprochemerin，其一级结构种属间高度保守，包括含有 163 个氨基酸蛋白和含有 20 个氨基酸的 N 端信号肽，N 端信号肽裂解后可形成 18kD 的 prochemerin[15]。二级结构包括氨基端的α螺旋结构，中间起桥梁作用的是反向平行β片层及羧基端的一段无序序列。循环中绝大多数 chemerin 是以低活性的 prochemerin 形式存在的，需要进一步裂解成为有生物活性的 chemerin 亚型以加强局部的生物学活性[16]。在不同组织和细胞群中表达的多种酶系可将 prochemerin 加工处理成具有生物活性的 chemerin，因羧基端裂解位置的不同，其亚型的形成长度和生物活性亦不同[17]。目前，所有调节 chemerin 活性的蛋白酶都是通过羧基端发挥作用的，说明 prochemerin 蛋白的这个区域对于 chemerin 的生物活性非常重要。此外，一些蛋白酶例如弹性蛋白酶和类胰蛋白酶可在多个部位加工处理 prochemerin，而且许多 chemerin 亚型也可被进一步加工[18]。
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三、pcDNA 3.1(+)-chemerin 对糖尿病肾功能不全大鼠.......49
3.1 对象和方法 ..........49
3.2 结果 ....55
3.2.1 动物的成模情况及体征观察 ..........55
3.2.2 各组大鼠肾脏组织 TNF-α、IL-1 水平 ............56
3.2.3 实时定量 PCR 检测结果 .........57
3.2.4Western Blot 检测结果 ....59
3.3 讨论 ....63
3.4 小结 ....68
四、血清 chemerin 与肾功能衰竭患者的关系...........69
4.1 对象和方法 ..........69
4.2 结果 ....70
4.2.1 一般临床指标的比较 ....70
4.2.2 各组血清 chemerin 水平的比较 ......71
4.2.3 男性和女性肾衰竭患者血清 chemerin 水平的比较 ..........72
4.2.4 肾衰竭患者各临床指标与血清 chemerin 的联系 .....72
4.3 讨论 ....73
4.4 小结 ....78
四、血清 chemerin 与肾功能衰竭患者的关系
chemerin 可能是肾功能衰竭的病理生理改变其中原因之一。换句话说，血清chemerin 水平增加只是反映肾功能降低还是导致肾功能下降的罪魁祸首呢？肾功能衰竭是许多肾脏病变的自然进程，导致在许多情况下需要肾脏替代治疗。本研究旨在探讨 chemerin 在糖尿病肾病肾功能衰竭患者中的变化，分析其与临床各指标间的联系。
4.1 对象和方法
4.1.1 研究对象
肾功能衰竭患者 97 例来源于 2013 年 10 月至 2014 年 3 月天津第一中心医院收治的患者，收集患者的临床资料及全血标本，其中男 50 例，女 47 例，年龄 25～88 (65.1±14.6)岁，均符合 2012 年改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）发布的《CKD 评估与管理临床实践指南》对于肾功能衰竭的诊断标准。排除标准：(1)过度肥胖者。(2)正在服用影响糖脂代谢的药物者。(3)正在进行血液净化治疗者：包括血透及腹透等。对照组来自门诊健康体检人群，共 45 例。排除标准：(1)过度肥胖者。(2)有糖尿病家族史者。(3)有糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、脑卒中史、肝功能不全者。(4)正在服用影响糖脂代谢的药物者。
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结论
1、为进一步研究糖尿病肾病的发病机理，我们成功的构建了真核表达质粒pcDNA 3.1(+)-chemerin，并利用脂质体法成功转染大鼠系膜细胞，为下面的进一步实验打下了坚实的基础。
2、高糖、真核表达质粒 pcDNA 3.1(+)-chemerin 单独作用及二者联合干预大鼠系膜细胞后，RT-PCR 及 Western blot 发现系膜细胞中 TGF-β1/Smads/CTGF 通路各蛋白包括 TGF-β1、Smad2、Smad4 和 CTGF mRNA 及蛋白表达均有增加，说明 chemerin 可能通过直接或间接途径上调 TGF-β1/Smads/CTGF 通路，加重系膜细胞纤维化及硬化，导致糖尿病肾病。另一方面，chemerin 增加炎症因子 TNF-α、IL-1 水平，提示 chemerin 可能通过增加炎症介质的产生，加重靶器官的炎症反应，加速系膜细胞损伤，从而诱发糖尿病肾病。综上，在体外试验中，发现了chemerin 对于纤维化通路及炎症因子的影响，提示其在糖尿病肾病的发病机制中具有重要促进作用。
3、DRI 大鼠模型中 TGF-β1/Smads/CTGF 通路各蛋白包括 TGF-β1、Smad2、Smad4和 CTGF mRNA 及蛋白表达均有增加，炎症因子 TNF-α、IL-1 水平升高。使用真核表达质粒 pcDNA 3.1(+)-chemerin 作用于正常大鼠后，TGF-β1/Smads/CTGF通路各蛋白 mRNA 及蛋白表达均有增加，炎症因子 TNF-α、IL-1 水平升高，而作用于 DRI 大鼠后上述指标升高更加明显。说明在体内试验中，肾脏纤维化及炎症因子的浸润在糖尿病肾病的发生发展、肾功能的恶化方面具有重要意义；而 chemerin 与肾脏纤维化及炎症因子密切相关，能够加速二者的表达，提示chemerin 可能通过上调 TGF-β1/Smads/CTGF 通路及炎症因子在糖尿病肾病中晚期发挥重要的促进作用。
4、糖尿病肾衰竭患者血清 chemerin 水平明显高于非糖尿病肾衰竭患者，提示血清chemerin水平与糖尿病肾病发生、发展有关。另外，血清chemerin水平与BUN、Cr、SBP、TG、CRP 呈正相关，而与 Ccr 呈负相关，提示血清 chemerin 水平与肾功能恶化、血脂异常、血压升高、炎症反应密切相关，可能参与肥胖、代谢综合征、高血压病、糖尿病、糖尿病肾病、肾功能衰竭的病理生理机制。
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参考文献（略）