第一章 绪 论
1.1 研究背景
有关于正畸致牙根吸收问题的探讨，是 1856 年由 Bates[4]首次提出的，此后，国内外学者对牙根吸收问题日益关注，围绕这一问题一直进行着相关研究。恒牙的牙根吸收同乳牙的生理性牙根吸收是不同的[5]，其与病理性炎症相关，如感染，创伤，肿瘤[6]，牙齿疾病[8]和牙齿种植等[7,9,10]。根尖外牙根吸收是正畸治疗中一种比较常见的不良反应和并发症[11]，Brezniak[8]等认为应称其为正畸导致的炎性牙根吸收（Orthodontically induced inflammatory root resorption，OIIRR）。牙体组织结构与骨骼的性质和特点相似，研究证实介导牙根吸收的破牙骨质细胞与介导骨吸收的破骨细胞（Osteoclast, OC）在形态、功能上也是相似的[12-15]。目前，对于正畸治疗所引起的牙根吸收的原因及其机制尚无明确的研究结果来论证。对于牙根吸收的原因，总体上可归纳为两个大类：患者自身因素和治疗相关因素。患者自身因素，可以理解为内部因素，包括遗传基因[16,17]、个体敏感性、不良习惯、患者本身的健康状况、患者性别、年龄、错牙合的严重程度、牙根形态[18]及发育情况等。Abass等学者的研究显示OIIRR具有多基因遗传，家族易感性的性质，某些基因型的变化与其相关[16,17]，而且不同人种的易感性也不尽相同，与白种人和拉美的正畸患者OIIRR的发生率相比较，亚裔患者牙根吸收相对较少[18]。患者本身的牙根形态也是重要病因之一，例如弯根，短根，吸量管状根，尤其在上颌侧切牙[18]。治疗相关因素，也称之外部因素，包括矫治力的施加、牙移动方式方向和距离、所使用矫治机理、选用的矫治方案、疗程等[19-20]。正畸的生物学过程中，应用适当的力值可以使牙齿在不断发生适应性改建的牙槽骨中产生移动，而牙骨质则保持相对的稳定。但越来越多的实验研究已经证实，在正畸牙移动过程中，受到机械性压力侧的牙骨质也会出现破牙骨质细胞所导致的病理性吸收[12,13,21]，这是一个高度复杂的生物反应过程，细胞把机械性应力转化成了其内部的分子生物学反应，众多信号通路、信号因子参与其中，从而构成机体内复杂有序的网络调控系统[13,22,23]，进而诱导和刺激效应细胞行驶和发挥其功能。
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1.2 课题的研究思路
通过整理分析文献，我们发现 PTP-oc 是一种特异性表达于破骨细胞前体细胞及破骨细胞的蛋白质酪氨酸磷酸酶，对破骨细胞起到正调节的作用。PTP-oc可以使 c-Src 蛋白 527 位点的酪氨酸残基磷酸化，进而激活 c-Src 所介导的破骨细胞信号通路。因此，我们认为特异性的对 PTP-oc 的活性进行抑制，破骨细胞的分化及其活性必然会受到相应的抑制，这样，最终可以在一定程度上有益于正畸致牙根吸收的预防和治疗。为了验证这一假设，本研究将对 PTP-oc 催化结构域进行分子克隆，表达纯化及酶学表征，确定其酶学性质。然后，利用比色法拟从多种单体化合物中筛选出对 PTP-oc 具有抑制效果的抑制剂，通过酶促反应动力学实验确定抑制剂的抑制类型及抑制常数 Ki，并且确定其专一性，选择其进行下一步的研究。在细胞水平上，研究筛选出的单体化合物对破骨样细胞分化和活性的相关影响，然后再从动物水平上检测该单体化合物对大鼠牙根吸收模型可能产生的影响，进而试图探寻正畸牙移动致牙根吸收可能的预防和治疗方法。
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第二章 PTP-oc 基因催化结构域的克隆表达
破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（Osteoclastic protein tyrosine phosphatase，PTP-oc）是一种特异性表达于破骨细胞的 PTP[66,75,76,84-88,90]，对破骨细胞具有重要正性调节作用[75,84-88]。到目前为止，对于 PTP-oc 的相关研究非常少，其对破骨细胞的作用机制尚不明确，降低或抑制 PTP-oc 的活性对于正畸致牙根吸收是否存在影响也无相关实验研究。由于国内外并无对人源 PTP-oc 基因克隆表达的研究，为了进一步深入探讨 PTP-oc 与正畸致牙根吸收的相互关系，我们将对人源 PTP-oc 基因的胞内单一催化结构域进行克隆表达。
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2.1 设备和材料
2.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌 BL21(DE3) Edmond H. Fischer Signal Transduction Laboratory
质粒 pET-28a(+) 赵志壮教授惠赠
质粒 pMD18-T 赵志壮教授惠赠
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2.1.2 主要设备
Master cycler gradient PCR 仪 Eppendorf 德国
NanoDrop ND-1000 Thermo Scientific 美国
Biofuge strato 冷冻高速离心机 Sorvall 美国
超声波细胞粉碎机（JY92-20） 宁波新芝生物科技有限公司 中国
FATO 超净工作台 苏州净化设备有限公司 中国
核酸电泳仪 Bio-Rad 美国
GEL DXR 凝胶成像系统 Bio-Rad 美国
微型振荡器（MH-1 型） 上海金鹏有限公司 中国
恒温空气震荡器 哈尔滨东联电子技术公司 中国
pH 计（DELTA 320） Mettler-Toledo 瑞士
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2.2 方法
我们依据人源 PTP-oc 催化结构域（ΔPTP-oc）的基因序列（NCBI gene ID:NM-030669.2），利用 prime 5 引物设计软件设计并从北京华大基因公司合成了5′ 端和 3′ 端引物，并且在引物的 N 端加入 Nco I 限制酶切位点和 C 端加入 XhoI 限制酶切位点。待扩增的 ΔPTP-oc 片段大小为 768bp，是 PTP-oc 基因 cDNA序列中从 861-1646 的一段序列，该段基因编码 255 个氨基酸残基，分子量为29.93kDa。引物设计如下：）在提取 RNA 前配制 0.1% DEPC 水 1500ml，浸泡实验所用物品（枪头，PCR管，离心管，纱布等），浸泡过夜后，用锡纸包起来 180℃烘烤 12h 以去除 RNA酶，先降温再把已烘烤完的实验器材等放进-80℃，备用；将电泳槽的电泳液换新的，用配好的 0.1% DEPC 水提前把电泳槽冲洗干净，最好浸泡一天；电泳液用 0.1% DEPC 水配好备用。
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第三章 PTP-oc 基因催化结构域的分离纯化......31
3.1 材料和仪器 ...........31
3.1.1 试剂及柱料 ....31
3.1.2 主要仪器 ........31
3.1.3 主要缓冲液的配制 ........32
3.2 方法 .......32
3.3 结果与讨论 ...........41
3.4 小结 .......46
第四章 PTP-oc 基因催化结构域抑制剂的筛选........47
4.1 设备和材料 ...........47
4.2 方法 .......48
4.3 结果与讨论 ...........51
4.4 小结 .......55
第五章 熊果酸对 U937 细胞诱导后破骨样细胞分化........57
5.1 主要设备和试剂 ...........57
5.2 方法 .......59
5.3 结果与讨论 ...........66
5.4 小结 .......73
第六章 熊果酸对大鼠牙根吸收模型的影响
牙根吸收是临床正畸治疗中的常见并发症，主要表现为牙骨质及牙本质的局限性缺损，通常发生在压力侧，其吸收过程是在诸多信号因子作用下调控完成的，相关的调控机制研究，对预防和治疗牙根吸收具有重要意义。c-Src 蛋白可以介导破骨细胞相关信号通路，与破骨细胞的分化及活性息息相关。PTP-oc可以使 c-Src 蛋白 527 位点的酪氨酸残基去磷酸化[66,75,76,87,88,90]，c-Src 蛋白由失活状态转变为具有 PTK 活性的酶，参与信号转导中的磷酸化，激活相关的网络调控。同人类的正畸治疗相似，大鼠的牙周组织受正畸力影响也会发生相应改建，牙齿发生位置的移动，其牙根表面也会有牙根吸收的发生。以上研究发现，UA 通过对 PTP-oc 酶活力的抑制作用而降低了诱导细胞向破骨样细胞的分化和活性，因而，UA 可能会对大鼠的实验性牙根吸收产生相应的影响，目前国内外并无相关研究。因而，本研究建立大鼠实验性牙根吸收模型，通过局部注射不同浓度的 UA，观察 UA 对大鼠牙根吸收的相关影响。
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结 论
本研究对 PTP-oc 催化结构域进行了分子克隆，表达纯化及酶学表征，利用比色法从多种单体化合物中筛选出了对 PTP-oc 具有抑制效果的抑制剂‐UA，通过酶促反应动力学实验研究确定了 UA 的抑制类型及抑制常数 Ki，并且确定了其专一性。在细胞水平上，研究了 UA 对诱导细胞向破骨样细胞分化和活性的相关影响，从动物水平上检测了 UA 对大鼠实验性牙根吸收模型产生的影响。通过以上实验结果，可以得出以下结论：
1. 虽然 PTP-oc 是一种结构特殊的蛋白质酪氨酸磷酸酶，通过改变诱导条件，我们可以对 PTP-oc 催化结构域（ΔPTP-oc）进行可溶性表达，其表达量随着诱导温度的降低而增加。
2. 利用亲和层析方法可以高效纯化 ΔPTP-oc，其酶学性质较其他的 PTPs相比，存在着一定的特殊之处，如最适 pH 为 7.0，最适反应温度为 34℃。对其酶促反应进行动力分析，得出 Km 值为 801.8μM，Vmax 为6.1μM/min，可以证实 PTP-oc 是一种高效的蛋白质酪氨酸磷酸酶。
3. 在分子水平，通过抑制剂筛选实验，发现 UA 能够有效抑制 ΔPTP-oc的酶活性，且具有较好的专一性。UA 对 ΔPTP-oc 的抑制类型为竞争性抑制，抑制常数 Ki 为 8.037μM，提示 UA 与 ΔPTP-oc 的催化位点有较强的亲和力。
4. 在细胞水平，UA 主要通过抑制 PTP-oc 的活性，升高 c-Src Tyr527的磷酸化水平，进而抑制 c-Src 介导的信号通路，影响破骨样细胞的分化及活性。
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参考文献（略）