第 1 章 绪论
1.1 骨细胞外基质微环境与骨组织工程
细胞外基质（Extra cellullar matrix,ECM）在组织生长和修复中起到非常关键作用，是支持细胞生长的支架，同时也是体内生长因子和细胞因子的储存库。细胞通过结合成骨细胞上受体如整合素、跨膜蛋白多糖与细胞外基质分子引起细胞骨架变形，进而活化第二信使和改变细胞基因表达、细胞的粘附、分化、增值、迁移、生长和死亡。细胞功能改变的同时分泌的 ECM 也发生改变，因此 ECM 也在不断的更新和变化[1]。ECM 最重要的功能之一是作为细胞因子和生长因子储存库螯合并修饰细胞因子，防止过早扩散和降解，在“需要时”螯合因子才被释放和活化。骨组织中，被螯合的因子可在破骨细胞吸收骨时被释放和激活，这可以确保维持骨重塑和生长所需的足够浓度的生长因子。生理上，骨组织是主要的钙和磷的储存库，骨中约 70%的成分为羟基磷灰石晶体，因此钙磷等矿物盐成分构成了骨组织最重要的微环境。骨形成之初，为了能够矿化，成核抑制因子和促进因子之间平衡的必须有利于矿化。人体的大多数组织包括骨组织在内，其矿化通常被分子晶体抑制剂抑制[2, 3]。机体内最重要的矿化抑制剂就是焦磷酸盐,通过结合新形成的 HA 晶体，终止磷酸根粒子与晶体结合从而抑制矿化。焦磷酸盐由两个磷酸根粒子通过酯键（Ester bond）相连组成，通过跨膜蛋白如 AnK 和 Empp1 分泌到 ECM 中。实验表明不仅在正常成骨时，异位成骨时去除或降低焦磷酸盐也能增强骨沉积[4]。对于矿化促进因子，如组织非特异性碱性磷酸酶（Tissue non-specific alkaline phosphatase，TNAP），一种膜结合的磷酸酯磷酸酶，通过提供游离的无机磷酸盐(Pi),并水解无机焦磷酸(PPi)来促进骨矿化。TNAP 灭活后，会导致佝偻病和骨软化症[5]。TNAP 缺陷鼠在焦磷酸盐存在时，其细胞外基质不能矿化；且研究表明 TNAP功能的决定了磷酸和焦磷酸盐的比例，这对于矿化非常重要。骨微环境中这些成核抑制剂（焦磷酸盐和基质 γ-羧基谷氨酸蛋等）与矿化促进因子（TNAP 等）之间的平衡决定了组织能否矿化[3]。
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1.2 骨生物化学信号分子微环境与骨组织工程
骨的生化环境是一种活跃的动态系统，是细胞行使功能和促进其行使功能的场所，细胞在其中产生骨基质和成骨。其中的每种组成成分能够向临近的细胞传递重要的调节信号，在细胞器水平影响基因的表达和细胞结构。骨中的信号分子主要包括激素类、细胞因子和生长因子。这些信号分子影响细胞迁移、粘附、增殖、分化、转录和翻译。信号分子通过自分泌，旁分泌，内分泌等形式在局部和通过全身系统影响细胞功能。调节全身钙稳态的激素主要是甲状旁腺激素和降钙素。当血清钙浓度降低时，甲状旁腺会反应性的分泌PTH，促进破骨细胞激活吸收骨而释放钙离子，同时可促进肠道和肾脏的钙吸收。在骨微环境中PTH通过结合成骨细胞膜上PTH受体，上调成骨细胞的RANKL表达，再结合破骨细胞前体细胞的RANK受体，促使他发育成成熟的有功能的破骨细胞。PTH会导致IL-6产生，它（IL-6）是破骨功能强有力的激活剂[38]。有趣的是，PTH除了能够激活破骨细胞外，还具有温和的刺激成骨细胞活化作用。小剂量间歇性的“脉冲”全身给予PTH，可以增加骨转换、全身骨密度、减少绝经后妇女骨质疏松症者脊椎骨折率[39]。因此，根据PTH的生物学特征，Wei等人利用PLGA微球控制释放生物活性的PTH，在骨组织工程中具有很好的应用前景[40]。此外，Jung 等人构建了RGD序列修饰的聚乙二醇基质，然后通过共价键将PTH与基质结合，体内可以明显促进种植体周围骨形成[41]。
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第2章 Gel/HA改性PLGA纤维支架成骨诱导活性及体内宿主反应
2.1 实验材料和仪器
明胶（美国 Sigma 公司），羟基磷灰石（直径＜200 nm，美国 Sigma 公司）；PLGA（PLA:PGA=85：15, 分子量=106000，购买于长春应化所）；六氟异丙醇（HFIP；中国阿拉丁试剂公司）；小鼠前成骨细胞 MC3T3-E1；α-DMEM 培养基（购自美国 GIBCO 公司）粉剂；胰蛋白酶粉剂（宝泰克生物有限公司）；胎牛血清(FCS)（购自美国 GIBCO 公司）；MTT 粉剂（噻唑蓝，美国 Sigma 公司）；青霉素/链霉素溶液（GIBCO，美国）；罗丹明标记的鬼笔环肽 (Invitrogen, Eugene,OR,美国)；4',6-二脒-2-苯基吲哚(Sigma-Aldrich，美国)；SYBR Premix Ex TaqTM（大连 Takara 公司，中国）； RNA 提取试剂盒（北京德迈德公司，中国）；PrimerScript RT reagent Kit(大连 Takara 公司，中国)；抗原修复液（AR0026, 武汉博士德生物工程有限公司）；复合蛋白酶（AR0022，武汉博士德生物工程有限公司）；CD68 免疫组化试剂盒（迈新生物技术开发有限公司，福州）；CD68抗体（鼎国昌盛生物技术有限责任公司，北京）；Wistar 大鼠（6 周龄）；多聚甲醛（分析纯，北京化工厂）；利多卡因和异氟烷（军事医学科学院长春军事兽医研究所）；乙二胺四乙酸二钠（EDTA，分析纯，北京化工厂）；紫外分光光度仪（Shimadzu 3100 UV-vis-near-IR spectrophotometer）高压静电纺丝装置；JB-2型恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）；场发射扫描电子显微镜（FESEM, JEOL JEM-6700F，日本）；接触角仪（上海方瑞仪器有限公司）；恒温水浴箱（上海医疗器械五厂）。CO2恒温细胞培养箱（SANYO 公司，日本）；酶标仪（RT-6000，深圳雷杜生命科学技术有限公司）；激光共聚焦显微镜(FluoViewTM FV1000, Olympus，日本)；倒置荧光显微镜及照相系统（Olympus公司，日本）；正置光学显微镜(Olympus BX51，日本)；环形去骨钻（Dentechcorporation，日本）；自动脱水机（LEICA TP1020，德国）；涡轮机（吉林大学口腔医学院）；包埋机（TB-718E，湖北泰微医疗科技有限责任公司）；旋转石蜡切片机（Thermo FINESSE 325，英国）；电推剪（KP3000，深圳科德士电器有限公司）；Image-Pro Plus（Media Cybernetics,Rockville, MD, 美国）。
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2.2 实验方法
PLGA 静电纺丝溶液制备：将 PLGA 溶于六氟异丙醇溶液中制备 10%（w/v）的静电纺丝溶液。PLGA/Gelatin/Hydroxyapatite（PGH）静电纺丝溶液配制方法：0.06g 纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)均匀分散于 3ml 六氟异丙醇（1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol， HFIP）中，磁力搅拌 24h；再将 0.3g 明胶（Gelatin，Gel）加入到溶液中获得 10%（w/v）溶液，然后将混合液持续搅拌48h以上以获得均一的溶液；此外，将0.7gPLGA加入到7ml HFIP中同样获得 10%（w/v）溶液，最后将上述两种溶液混合，磁力搅拌 6h 制备出 PGH 静电纺丝溶液。利用 1ml 注射器吸入上述两种静电纺丝溶液，将注射器针头更换为 18 号钝头注射器针，调节针头与接收器的距离至 15 厘米，将变压器阳极和接地线连接妥当开启变压器电源，将电压缓慢调至 15KV，使用自动推进器以1ml/h 的速度推进液体，制备出 PLGA 和 PGH 两种静电纺丝纳米纤维。静电纺丝模式图如下：我们采用场发射扫描电子显微镜观察制备的静电纺丝纤维支架材料的表面形貌和纤维粗细。将制备的纤维支架材料剪成合适大小粘在样品台上，并用导电胶连接纤维与样品台，在样品表面喷一薄层铂以降低材料表面电荷。将样品台送入SEM样品仓，调节电压至3KV，观察纤维支架表面形貌并照相。通过Image-Pro Plus软件分析制备的PLGA和PGH纤维的粗细及其分布范围。此外，我们采用原子力显微镜(Atomic force micro-scope，AFM)分析单个纤维的表面粗糙度。将原子力显微镜调节至Tapping模式，将样品放在样品台合适位置，调节显微镜参数，观察单个纤维表面粗糙度并拍摄照片，通过软件分析获得具体的表面粗糙度值。
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第 3 章 仿生 GEL/HA 纤维支架载 B-GP/AA 促骨再生研究..........37
3.1 实验试剂和仪器............37
3.2 实验方法 ......37
3.3 实验结果 ......39
3.4 讨论 .....43
第 4 章 仿生 GEL/HA 纤维支架载 EPO 促骨再生研究.........47
4.1 实验试剂和仪器............47
4.2 实验方法 ......47
4.3 实验结果 ......48
4.3.1 新生骨量........48
4.3.2 组织学分析结果.....50
4.4 讨论 .....52
第 5 章 结论 .........55
第 4 章 仿生 Gel/HA 纤维支架载 EPO 促骨再生研究
促红细胞生成素（Erythropoietin ，EPO）是一种由缺氧诱导产生的糖蛋白类激素，对于体内红细胞的生成是必不可少的。临床上，EPO 常用于治疗慢性肾病导致的贫血。然而其生物学功能远远超出其促进红细胞生成作用，如促进骨形成和促进血管形成等[46,99]，并且已经有报道其他很多非红系细胞表达 EPO受体[100]。然而其在骨重塑中的调节作用具体机制仍不清楚，最近的研究表明EPO 能够通过 EphrinB2/EphB4 信号通路调节骨重塑和促进骨形成[101]。因此，我们将 EPO 引入上述合成的 GH 纤维支架内，构建激素类骨生物信号分子修饰的 GH/EPO 骨组织工程支架材料，并通过植入大鼠颅骨缺损检测其体内修复大块骨缺损能力。首先根据上述方法制备GH纤维支架材料（具体方法和支架形貌见第4章）。将交联好的 GH 纤维支架材料剪成直径 5mm 的圆片，将 100u 的 EPO 滴加到纤维膜上（若纤维膜太薄可将两片叠加在一起）放入-70 度冰箱预冻，然后放入冻干机中冻干备用。
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结论
1、与纯 PLGA 纤维支架相比，PLGA/Gelatin/Hydroxyapatite 复合纤维支架体外具有更好的支持成骨细胞粘附和生长作用，并具有更好的成骨诱导活性，在体内诱导的炎症反应更弱，具有更好的生物安全性。
2、载 AA/β-GP 的仿生 Gelatin/Hydroxyapatite 支架材料具有良好骨传导性和骨诱导性，能够作为模型指引骨形成和诱导矿化，是优良的骨组织工程支架，有望快速实现临床转化。
3、载 EPO 的 Gelatin/Hydroxyapatite 支架体系具有很好的骨传导性，同时 EPO能够提升骨断端与支架材料之间的骨再生微环境和激活成骨细胞功能，促进骨缺损修复。因此载 EPO 的 Gelatin/Hydroxyapatite 支架体系有望应用于临床治疗骨缺损。
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参考文献（略）