第一章 文献综述
1.1 杜仲生物活性成分研究进展
木脂素类化合物多为无色晶体，常以游离形式存在，可溶于有机溶剂中，难溶于水。迄今为止，已经发现杜仲叶中含有 27 种木脂素类化合物，多为苷类，有双环氧木脂素等五种母核结构，其结构式如图 1.1 所示。木脂素是杜仲叶中的主要活性成分之一，是众多类活性成分中结构最清晰、成分最明确的一类化合物，不仅如此，该类化合物也是在化学中研究最多的一类物质。包括 14 种双环氧木脂素类、5 种新木脂素类、4 种单环氧木脂素类、3 种倍半木脂素类以及 1 种环橄榄脂素类[3]。目前主要对丁香脂素和松脂素有较多的研究，多数化合物以甙的形式存在。木脂素类化合物具有抗炎、抵抗病毒、保肝、降低血压、抗肿瘤以及增强机体免疫力的作用，同时还可以抑制血小板活化因子功能[4]。许激杨[5]（2006）等以大鼠胸主动脉环为标本，对木脂素类化合物降血压机制进行研究，结果显示杜仲中含有的木脂素类化合物有明显的舒张血管作用，进而使血压降低。其作用机制不仅与内皮依赖性有关，而且 ATP 敏感性 K+通道也参与了木脂素类化合物舒血管作用。Sang Hyun Sung[6]等以小鼠为实验动物做保肝实验，结果显示木脂素类化合物具有良好的保肝作用。除此之外，松脂素双糖苷、丁香脂素双糖苷以及橄榄脂素双糖苷在抗肿瘤方面也具有较高的活性。
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1.2 杜仲药理作用研究进展
1.2.1 杜仲具有抑菌、抗肿瘤、抗炎作用
杜仲中含有绿原酸、桃叶珊瑚苷以及黄酮类等多种生物活性成分对多种病原菌都有很好的抑制作用。研究表明，杜仲水煎剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、结核杆菌、福氏痢疾杆菌、绿脓杆菌、炭疽杆菌等都有抑制作用[38]，孙健[39]等(2009)研究发现绿原酸对金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、无乳链球菌有良好的抑制作用，伊文君[40]也证实了这一点，同时，研究显示绿原酸对蜡样芽胞杆菌和白色葡萄球菌也有较好的抑制效果。孙燕荣[41]以合胞体的产生作为评价指标，探究中药杜仲及其单体化合物对 HIV 的作用，其试验模型为感染 HIV 病毒的MT4 细胞，结果显示，杜仲提取物及其分离出的单体化合物对 HIV 病毒都有抑制作用。同时，吕琳等人也报道称，杜仲中所含有的活性成分对 HIV gp41 六股螺旋束有较好的抑制作用，但其活性成分可能不包括鞣酸[42]。有研究发现不同炮制、不同剂量的杜仲叶、杜仲皮对采用二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀都有抑制作用，表明了杜仲叶、杜仲皮具有较好的抗炎效果，同时，其效果还与剂量成正相关[43]，周程艳等人也证实了杜仲具有显著的抗炎作用，除此以外还提出杜仲具有一定的镇痛作用[44]。
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第二章 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验药品
绿原酸标准品（中国食品药品检定研究院，批号:110753～200413）；乙醇、乙酸丁酯（天津市永大化学试剂有限公司）；氢氧化钠、氯化钠（天津市光复科技发展有限公司）；吐温-80（天津市瑞金特化学品有限公司）；亚硫酸氢钠、维生素 C、焦亚硫酸钠（天津市致远化学试剂有限公司）；明胶、磺基水杨酸（天津市复兴精细化工研究所）；活性炭（上海宝曼生物科技有限公司）；营养肉汤（中国检验检疫科学研究院）；肉汤琼脂培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）；甲酸（天津博迪化工股份有限公司）；氯化钙（天津市科密欧化学试剂有限公司）乙二胺四乙酸二钠（天津市大茂化学试剂厂）；四苯硼钠（上海榕柏生物技术有限公司）；甲醛（烟台三和化学试剂有限公司）。
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2.1.2 试验动物
家兔、小白鼠、豚鼠（长春生物制品研究所）。
2.1.3 试验器材
1200 型高效液相色谱仪（美国 Agilent）；DGG-9240 电热鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；DK-S12 型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；DRP-9272 型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；AL204 电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；YXQ-LS-75S11 型立式高压蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SH2-Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；实验室 pH 计 FE20（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；P-2010 平底薄层色谱展开缸（上海楚定分析仪器有限公司）；生物洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；T6 紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；全温振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；
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2.2 试验方法
色谱条件：色谱柱为 Sepax Bio-C18（250 mm×4.5 mm，5 μm，美国 Sepax 公司）；流动相：88%A（磷酸缓冲液，0.03 mol/L，pH 值=4.71），12%B（乙腈）；流速为 1.00 mL/min；柱温为 28℃；UV 检测波长为 328 nm；进样量为 10 μL。绿原酸标准液制备：精密称取绿原酸标准品 15 mg，加入注射用水使其充分溶解，制成绿原酸标准液 15 mg/mL，再用注射用水稀释成不同浓度备用，以峰面积为纵坐标，绿原酸含量为横坐标，绘制绿原酸标准曲线。取杜仲叶提取物溶于注射用水，适度浓缩后加入乙醇，使药液乙醇浓度为 75%，4℃避光静置 24 h，3000 r 离心 20 min，过滤，回收乙醇，将药液浓缩至杜仲叶提取物浓度为 1.5 g/mL。向浓缩后的药液中加入 4%的明胶，至不在产生沉淀为止，避光静置 30 min，加入乙醇，使药液乙醇浓度为 85%，4℃避光静置 24 h，3000 r 离心 30 min，过滤，回收乙醇，将药液浓缩至杜仲叶提取物浓度为 2 g/mL，避光置于 4℃冰箱中，备用。
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第三章 试验结果.....21
3.1 杜仲注射液的研制结果 ........21
3.2 杜仲注射液质量检查结果 ....25
3.3 杜仲注射液稳定性研究结果 ......30
3.4 杜仲注射液体外抑菌试验结果 ........32
第四章 讨论.......33
4.1 杜仲注射液的研制 ....33
4.2 杜仲注射液的质量检查 ........34
4.2.1 相关物质检查......34
4.2.2 安全性检查....34
4.2.3 含量测定........35
4.3 杜仲注射液稳定性研究 ........35
4.4 杜仲注射液体外抑菌效果的研究 ....36
第五章 结论.......37
第四章 讨论
4.1 杜仲注射液的研制
中药注射液成分复杂且不稳定，中药提取液中常含有鞣质、蛋白质、树脂以及色素等多种高分子物质，这些物质以胶体状态存在，当温度或溶液 pH 值发生变化时，胶体将老化以浑浊或沉淀的形式存在，影响注射液的澄明度，同时蛋白质、鞣质以及树脂的存在会影响注射液的安全性，注射时会产生疼痛或硬结以及吸收困难等问题。因此，本实验采用醇沉和改良明胶法去除蛋白质、色素、鞣质等物质，在注射液制备前对杜仲叶提取液进行预处理。杜仲叶提取液中含有绿原酸、黄酮以及多糖等多种生物活性成分，可以清除自由基，具有抗氧化作用。在抗氧化剂存在的条件下，氧首先与抗氧化剂反应，从而起到保护主药不被氧化，保持注射液稳定性的作用。常用的抗氧化剂主要有亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素 C 以及维生素 E 等，其中亚硫酸钠和硫代硫酸钠适合偏碱性的药物；维生素 E 适合用于对热稳定，油性药液；亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、维生素 C 适用于偏酸性药液，杜仲叶提取液偏酸性，因此选用上述三种。试验表明出亚硫酸氢钠效果最好，而亚硫酸氢钠常用浓度范围为 0.05%～0.2%，在不同浓度亚硫酸氢钠筛选试验中可以看出，当亚硫酸氢钠为 0.14%时综合评分较好。常用的中药增溶剂有吐温-80 和胆酸盐，其中胆酸盐适合 pH 值在 6 以上的中药注射液，pH 值在 6 以下时，胆酸易析出；而吐温-80 是注射液中用的较多的增溶剂，但如果吐温-80 含量过高会引起溶血，因此吐温-80 的用量是整个试验的关键点，吐温-80 常用浓度范围为0.04%～0.15%，试验显示添加 0.05%的吐温-80 时效果最好。
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结论
1、杜仲注射液的制备工艺为：在预处理后的杜仲叶提取物中加入 0.14%亚硫酸氢钠（W/V）和 0.05%吐温-80（V/V），pH 值=5，0.2%药用活性炭（W/V），45℃吸附 25 min，0.45 μm微孔滤膜粗滤，0.22 μm 微孔滤膜精滤，分装，灌封。
2、杜仲注射液为棕黄色液体，杜仲叶提取物含量为 1g/mL，有效成分绿原酸含量不低于8 mg/mL，无可见异物以及相关物质，符合《中国兽药典》（2010 版二部附录）中热原检查、异常毒性检查、过敏检查以及溶血检查等安全性试验的相关规定。
3、杜仲注射液应室温避光保存，有效期最少可达 1 年，性质稳定，各项指标检查符合《中国兽药典》（2010 版）稳定性考察标准。
4、杜仲注射液对金黄色葡萄球菌高敏，对大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌中敏，最小抑菌浓度均为 0.125 g/mL；金黄色葡萄球菌最小杀菌浓度为 0.125 g/mL，其余三种细菌为0.25 g/mL；抑菌圈大小分别为 18.42 mm、14.21 mm、12.01 mm、12.89 mm。
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参考文献（略）