第一部分：福尔马林固定石赔包埋组织标本的蛋白提取方法的优化
引言
早在1991年，抗原修复的方法就已被提出⑴，使得福尔马林固定石錯包埋(FFPE)标本中抗原恢复免疫活性成为可能，由此免疫组织化学（IHC)成为获取以抗原抗体反应为基础的蛋白信息的重要实验手段。然而免疫学方法的成功依赖于抗体获取的难易程度及质量，因而往往耗时而昂贵。随着现代蛋白质组学方法的出现，使得我们有可能获得生物样本中全部蛋白组成的信息，为临床病理诊断带来了新的发展方向。FFPE标本能很好地保存生物组织形态，且保存年限长[2，3]，因而院内病理系统蕴含着丰富的回顾性分析素材。将FFPE标本与质谱蛋白质组学技术结合在一起，可用于探索不同病理状态下蛋白表达的差异，这在肿瘤临床基础研究领域已有了广泛的应用[4]。然而很长时间以来，标本在福尔马林固定过程中发生的蛋白-核酸、蛋白-蛋白共价交联以及蛋白降解很大程度上阻碍了蛋白提取[5]。虽然当前逐渐优化的蛋白提取液以及提取技术，使得从FFPE样本中获取蛋白用于蛋白质组学分析变得更为高效[6]，但目前尚无国际公认的蛋白提取策略。现今广泛应用的蛋白提取液一般都由去污剂、还原剂、变性剂及盐类组成。2010年，Ostasiewicz[7]利用含三轻甲基氨基甲烧（Tris)、二硫苏糖醇（DTT)和十二焼基硫酸钠（SDS)的裂解液，从肝脏组织中提取出了 155ng/mg蛋白。2012年，Wisniewski[8]等人在上述方案中加入聚乙二醇20000 (PEG20000)，继而在微量FFPE标本中成功提取出了万余种蛋白。上述提取液虽然被证实具有较高的提取效率，但是SDS的存在使其无法与质谱技术兼容，因而需要增加繁琐的去污剂去除流程。基于此，一些研究提出以尿素作为促溶剂代替SDS[9],但其整体提取效率却不尽如人意。梅奥诊所的研究人员利用含有Zwittergent3-16的提取液，从淀粉样变FFPE显微切割标本中获取蛋白，并成功实现了亚型鉴定[10],但关于Zwittergent 3-16与其他类型提取液相比是否具备优势却未有报道。近年来，石蜡标本蛋白提取试剂盒的出现也很大程度上简化了操作流程，同时保证了较好的提取效率，因而倍受青睐。
本实验中我们应用五种目前常用的蛋白提取液，对大鼠不同脏器的FFPE微切标本进行蛋白组成分析，确定最佳的蛋白提取液以及实验流程，并将其应用于后续的淀粉样变质谱分型。为了验证最佳裂解液是否同样适用于较大组织量的蛋白提取，我们进一步在大鼠FFPE普通切片标本中对比了五种裂解液的提取效率。
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1实验材料
1.1组织标本
SD大鼠（雄性，10周）心脏、肝脏、肺、脑、肾脏FFPE标本
1.2主要试剂
4%多聚甲醛中国，北京鼎国昌盛生物技术有限公司
水合氯醛中国，北京绿源博德生物有限公司
0.9%生理盐水中国，北京百奥森泰生物技术有限公司
Tris 美国，No von公司PEG20000 美国，Inalco 公司
Zwittergent 3-16 美国，Sigma 公司
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA)中雷，北京嘉美纽诺生物禾斗按有限：公司
---Dithiothreitol (DTT)美国，Inalco 公司
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)美国，USB 公司
FFPE-FASP蛋白分析试剂盒美国，Thermo公司
Urea中国，北京拜尔迪生物技术有限公司
Thiourea中国，北京拜尔迪生物技术有限公司
CHAPS 美国，Inalco公司
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2实验方法
2.1大鼠FFPE标本制作
2.1.1将SD大鼠用水合氯醛（5niL/kg)腹腔内麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。取出套管针内芯，连接医用输液器及0.9%生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后更换为4%多聚甲醛灌注。快速灌注50mL后放慢速度，缓慢滴注维持，每只大鼠约需灌注l00mL。
2.1.2灌注完成后将大鼠自枕骨大孔处用剪刀横断，于枕骨大孔斜插入剪刀剪开卢页骨，止血银辦断两侧顶骨，用剪刀于一侧剪断视神经并探至顿底，将整块脑组织翘起取出。仔细分离、剪断大鼠心脏、肝脏、肾脏、肺周围结构，依次取出。
2.1.3将所有脏器于4°C 4%多聚甲醛内固定过夜，依次行脱水、透明、浸蜡，制成FFPE标本。
2.1.4取脑、心脏、肺、肾脏、肝脏FFPE标本，切取厚度组织于普通载玻片上。另切取6cm厚度组织于激光显微切割（LMD)专用PET载玻片上。
2.1.5 FFPE组织切片标本行脱錯处理：二甲苯冲洗3次，每次5min; 100%乙醇冲洗2次，每次3min; 90%乙醇冲洗1次，3min; 80%乙醇冲洗1次，3min;清水冲洗1次，3min。室温条件下风干。
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第二部分系统性淀粉样变的激光显微......... 25
引言......... 25
实验材料......... 26
实验方法.........26
实验结果......... 29
讨论......... 36
小结......... 40
第三部分文献综述:原发性轻链型淀粉样变的治疗进展......... 47
4讨论
2008年，梅奥诊所首次提出通过LMD/MS的方法鉴定神经组织蛋白沉积物成分，从而确定疾病亚型。在5例淀粉样瘤中，均成功鉴定出SAP及限制性轻链表达。淀粉样变中致病性蛋白在局部沉积，较其他蛋白类型表达量更高，通过显微切割蹄选病变组织，减少杂质蛋白干扰，进而利用质谱鉴定组织内全部蛋白构成，根据表达丰度高低确定致淀粉样变蛋白，从而鉴定疾病亚型。真是基于这样的理论，梅奥进一步在心脏[25]、肾脏[44]、神经等淀粉样变受累组织中进行了质谱分型。Vrana[25]对50名已明确淀粉样变亚型的患者重新进行LMD/MS亚型鉴定，发现LMD/MS诊断的准确性及特异性均达到100%。而在41名患者心脏标本构成的验证组中，分型成功率达到了 98%。2012年，Sethi[44]等人报道了 127例肾脏淀粉样变的鉴定结果，122例获得成功分型，其中包括少见的ALet2型、AGel型、AApoA-I型和AApoA-IV型等。
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结论
我们通过滤过膜上样本处理、微波辅助酶切、蛋白鉴定结果判读标准优化等方面对LMD/MS鉴定淀粉样变亚型进行了方法学改进，并对133例患者中的121例进行了准确诊断，成功率达到91.0%。相较于传统的血清学检测及IHC,质谱鉴定具有明显优势。在各类型组织中，腹壁脂肪的诊断成功率相对较低，但因为腹壁脂肪活检具有操作简便、创伤小的优点，未来如何通过流程改进提高诊断准确率有待进一步研究。
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参考文献（略）