第一章引言
慢性阻塞性肺疾病（COPD)是一种不完全可逆的持续性气道阻塞。近年来同，全球COPD的发病率和死亡率和显著增加。COPD已经影响了将近3.29亿人群，约占总人口的5%。在2012年，超过3百万的人死于COPD,约占当年全球死亡数的6%。预测到2030年COPD将成为全球第三大死亡原因。气道枯液的过表达是COPD患者重要的病理生理特征。持续的气道枯液聚集为微生物的生长提供生存环境，从而引起气道的炎症及感染。枯蛋白是气道上皮细胞分泌的雅液的主要组成成分。MUC5AC作为呼吸道牿蛋白最主要的组成成分，在COPD的发生发展中起到了关键的作用。香烟烟雾被证实是COPD重要的病原学因素之一 ，且与枯液的过表达密切相关。据报道超过80%的COPD患者为吸烟人群19。目前发现COPD患者枯液的过表达可引起气道阻塞，加速肺功能的下降，增加其发病率11，I2及死亡率I3，I4。虽然目前香烟烟雾与COPD的关系已被广为接受，但其诱导粘液过表达的机制并未完全揭示。目前临床上，寻找一种安全有效的治疗香烟烟雾诱导的气道枯液高表达的干预措施非常迫切。因此，阐明香烟烟雾诱导牲蛋白（特别MUC5AC)过表达的机制，有助于我们发现治疗COPD的新靶点。
转录激活因子-3 (ATF3)是含亮氣酸拉链结构的ATF/CREB转录因子家族的成员之一 。ATF3作为一种适应性反应基因，参与适应胞内与胞外刺激的细胞反应过程。它能与bZip蛋白例如AP-1, C/EBP或Maf家族形成同源或异源二聚体，在细胞增殖、调亡、炎症反应及脾瘤发生中具有重要作用，ATF/CREB家族成员在ATF3在转录调控中发挥重要作用”。近年其对炎症反应的调节越来越受到关注。最近一项研究表明，ATF3可显著抑制过敏性蜂喘小鼠气道炎症反应，同时能抑制气道枯液的高表达。和炎症反应一样，枯液高表达是慢性气道疾病重要的病理特征。目前，关于ATF3是否参与调控枯液的表达的报道很少，在COPD中尚未有研究报道。ATF3的亮氨酸结构并不能直接结合到DNA上，但其却能调控基因的转录，这可能与其能阻止或促进协同作用因子结合到基因的启动子区域相关。在气道上皮细胞中已经证实AP-1的激活及其MUC5AC启动子区域的位点能正性调控香烟烟雾诱导的枯液的表达因此我们提出假设，ATF3通过募集ATF3和AP-1家族从而调控香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达,ATF3是香烟烟雾诱导的MUC5AC过表达的重要分子机制之一。
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第二章材料与方法
2.1香烟烟雾提取物
本研究中所用的香烟烟雾提取物来源于标准的研究香烟（来自肯塔基大学的香烟研究机构X将1支香烟的烟雾完全溶解到10 ml RPMI 1640培养基中，分装并保存于-80度冰箱中，用前取出4度溶解混匀。
2.2实验动物
实验动物为C57BL/6鼠，ATF3小鼠为美国TsonwinHai实验室馈赠，实验选用8-l0w雄鼠，体重20-22g, 6-8只/组，词养于浙江大学紫金港校区动物实验中心。
2.3使用的主要实验仪器与设备
4°C冰箱 Haier，中国
-20温度冰箱 SANYO，日本
-80 温度冰箱 Thermo Scientific,美国
光学显微镜 OLYMPUS，日本
5%C02 培养箱 Thermo Scientific,美国
微量移液器 Eppendorf，美国
满旋振荡器 Qilinbeler,中国
垂混仪 新芝公司，中国
水平摇床 Kylin-BeU，中国
垂直摇床 Kylin-BeU,中国
雪花制冰机 Ross Temp公司，美国
台式离心机 Thermo Scientific,美国
低温高速离心机 Thermo Scientific,美国
普通PCR仪 Bio-Red,美国
焚光定量PCR仪 ABI，美国
Western Blot 电泳仪 Bio-Red,美国
倒置双光子共聚焦显微镜 OLYMPUS,日本
病理图像成像仪 Leica，德国
酶标仪 Bio-Red,美国
风片机 Stetspin，以色列
2.4实验试劍与材料
2.4.1实验试剂与材料
1640 培养基 E1:G45 Gibco，美国
Ham's F12培养基 Gibco，美国
DMEMF12培养基 Gibco，美国
胎牛血清 Gibco，美国
青霉素链霉素潘合液 Sigma，美国
艘酶 Gibco，美国
Transfection reagent Genmute，美国
Transfection buffer Genmute，美国
siRNA Santa Cruz Biotechnology，美国
PloyJet SignaGen，美国
DNAsel sigma，美国
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第三章 研究结果........... 30
3.1香烟烟雾能诱导气道上皮细胞MUC5AC的分泌.......... 30
3.2香烟烟雾能诱导气道上皮细胞ATF3的表达.......... 31
3.3特异性敲除ATF3能下调香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达.......... 33
3.4ATF3过表达对香烟烟雾诱导的MUC5AC高表达无影响.......... 35
3.5特异性敲除ATF3能上调香烟烟雾诱导.......... 37
3.6香烟烟雾能激活ATF3-AP-1信号通路.......... 37
3.7体内实验中ATF3的缺失并不能缓解.......... 41
第四章讨论..........42
第五章结论.......... 45
第四章讨论
化学物质，过敏原，细菌等很多物质均能刺激气道上皮细胞分泌枯液21。枯液的高表达可导致气流受限，最终引起肺功能的损伤。气道枯液高分泌作为COPD一个典型的特征，抑制牿液的分泌成为了慢性气道疾病潜在的治疗觀点。本研究重点探讨了研究香烟烟雾引起的MUC5AC表达。据报道，香烟烟雾通过AP-1促进MUC5AC的表达20。在本研究中，体外实验发现ATF3能促进香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达，同时抑制IL-6、IL-8表达。香烟烟雾暴露可刺激ATF3的表达，同时激活并使AP-1蛋白碟酸化。另外，ATF3和AP-1蛋白转移入核形成ATF3-AP-1复合物，从而激活MUC5AC基因的转录。然而，体内关于气道MUC5AC表达的结果却与体外不完全一致。香烟烟雾可能通过促进气道牲液的分泌及气道炎症导致COPD的发生发展。体内及体外实验均表明，香烟烟雾能诱导MUC5AC的表达，從进炎症因子IL-6、IL-8的表达，增加气道周围中性粒细胞的浸润。AP-1转录因子，有Fos和Jun家族组成，其作为外在毒性刺激的生物传感器，在众多生物学过程调控基因的表达中起到重要作用。据报道AP-1的激活与香烟烟雾引起的枯液表达有关且参与促炎基因的表达。此外，在气道上皮细胞中特异性阻断AP-1能抑制香烟烟雾诱导的枯液的表达。
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结论
本课题中，我们体内利用CSE气道滴注和熏烟构建COPD模型和体外CSE干预人气道上皮细胞的方法研究ATF3在香烟烟雾诱导的气道拈液高分泌和炎症反应中的作用，得到如下结论：ATF3能促进香烟烟雾引起的气道上皮细胞枯液高分泌，抑制炎症因子IL-6，IL-8的表达，为治疗香烟烟雾引起的慢性气道疾病提供实验依据。
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参考文献（略）