一、材料与方法
1.实验材料
1.1 实验动物及细胞株
尘肺病是由长期吸入职业性生产性粉尘而引起以一组异质性纤维化性肺部疾病[1]。尘肺病是我国最常见的职业性疾病，矽肺是尘肺病中最常见的类型之一，矽肺肺组织结构病理性重构主要是由成纤维细胞过度增殖、细胞外基质过度积聚所致[2]。由于缺乏有效的治疗策略和对具体机制缺乏了解，矽肺仍然是世界性疾病负担[3]。因此深入探究矽尘所致肺纤维化的机制以及可能的治疗策略意义重大。
将 72 只无特定病原体（SPF）的四周龄雄性 C57BL/6 小鼠，体重 20-22g，经湖北省动物伦理委员会批准后购于湖北医药学院实验动物中心，饲养于湖北医药学院实验动物中心，SPF 级清洁环境，温度控制在 24±1℃，湿度 50%±5%，昼夜交替规律照明 7am-7pm，可自由饮水、饮食，每日更换敷料。
人 II 型肺泡上皮细胞（A549）购于中国科学院上海细胞库。
1.2 主要试剂
主要试剂
2.实验方法
2.1 动物实验方法
2.1.1 矽肺小鼠模型建立：
将 72 只 C57 小鼠在无特定病原体（SPF）环境下适应性饲养 1 周，随机分为四组（每组 18 只）：a.对照组；b.ISL 组；c.矽尘组；d.矽尘+ISL 组。造模前，对小鼠禁食 12h。根据小鼠体重使用 5μL/g 的 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠。麻醉起效后，将小鼠仰卧固定于实验台上，再将 100μL 结晶二氧化硅颗粒悬浮液（50 mg/mL）通过气管内滴注法注入肺中，以此组作为模型组[27]。无菌生理盐水为对照组采用相同方式注入等体积的无菌生理盐水。注射后，迅速将小鼠直立、左右翻转 5min，使 SiO2悬浊液在小鼠肺内均匀分布。观察小鼠状态，待其清醒后继续常规饲养。
2.1.2 ISL 干预
按照前期预实验筛选剂量，在造模后第 2 天，ISL 组和矽尘+ISL 组每天根据体重按照 ISL（20mg/Kg）腹腔注射给药，对照组和矽尘组根据体重腹腔注射等量生理盐水。
2.1.3 小鼠标本收集
（1）在造模后第 7、14、28 天时，用 1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，采用摘除眼球取血的方式，留取全血标本，室温静置 1h 后，3500rpm 离心 10min，取上清置于-80℃冰箱冻存备用；
（2）将小鼠固定，取出整肺，生理盐水洗去表面血渍，剔除结缔组织，观察肺脏外观。称取肺重后，将右肺全肺置于 4%多聚甲醛溶液中固定以制作石蜡切片，用苏木精-伊红（HE）染色和 Masson 染色观察其肺组织病理学变化；将其左肺组织液氮速冻，随后转移至-80℃冰箱备用。
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二、结果
1.动物实验结果
1.1 干预前后小鼠的一般情况及体重变化
对照组小鼠毛发色泽光亮、精神状态佳；ISL 组与对照组相比无明显变化；矽尘组与对照组相比造模后精神差、毛发蓬乱，活动欠佳，后期逐步恢复；矽尘+ISL组较矽尘组精神、毛发、活动度恢复速度稍快。如图 3.1 所示，对照组和 ISL 组小鼠体重变化趋势基本相同；与对照组和 ISL 组相比矽尘组及矽尘+ISL 组小鼠体重在造模后明显下降；与矽尘组相比矽尘+ISL 组小鼠体重在造模后增加速度稍快；随着时间的增加，各组小鼠体重均增加，不同分组小鼠体重变化不同（p<0.05）；小鼠体重在不同处理方式下，不同时间的变化趋势不同（p<0.05）（表 3.1）；由表 3.2 示与对照组和 ISL 组相比，矽尘组、矽尘+ISL 组 7 天、14 天、28 天肺系数明显增高（p<0.05）；矽尘+ISL 组在 7 天、14 天、28 天肺系数明显低于矽尘组（p<0.05）。
表 3.1 各组小鼠体重变化情况（n=6；单位：g）
2 细胞实验结果
2.1 ISL 抑制 A549 细胞活力
为确定 ISL 对 A549 细胞毒性作用，用（0、5、10、15、20、30、40、60、80mg/L）的 ISL 溶液处理 A549 细胞 24h 后，用 MTT 实验检测 ISL 对 A549 细胞生存率。结果如图 3.7 所示，ISL 以浓度依赖性方式抑制 A549 细胞生存。在 ISL 浓度为 15mg/L时，细胞的生存率为 84.46%，因此本实验使用 15mg/L 的 ISL 浓度进行后续实验。
图 3.7 ISL 抑制 A549 细胞存活率*p<0.05；***p<0.001
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1.动物实验结果.................................................24
1.1 干预前后小鼠的一般情况及体重变化............................... 24
1.2 小鼠肺部病理变化................................................ 25
1.3 小鼠肺组织 EMT 蛋白表达情况............................27
四、讨论................................ 34
五、结论........................ 37
四、讨论
矽肺是一种与工作相关的职业病，长期暴露在含有结晶二氧化硅颗粒的吸入性粉尘中，可发展为严重的肺部炎症和纤维化[30]。矽肺有三种形式（急性、加速和慢性），取决于接触二氧化硅颗粒的数量和时间，感染、慢性阻塞性肺疾病等其他肺部疾病可使其复杂化[31]。越来越多的证据表明，二氧化硅颗粒能激活巨噬细胞和肺泡上皮细胞，促使它们释放大量的细胞因子和氧化剂，进而导致成纤维细胞增殖、上皮-间充质转化（EMT）、细胞外基质沉积，最终导致纤维化（矽肺）[32]。在各种细胞因子中，转化生长因子-β（TGF-β）是一种多方面的细胞因子，在胚胎发育以及肿瘤和纤维化等病理生理条件下的炎症、增殖和上皮分化中发挥着不同的作用[33]。在组织纤维化中，TGF-β通过启动纤维化信号发挥关键作用[34,35]。TGF-β还通过诱导肺泡上皮细胞 EMT 和成纤维细胞分化在促进肺纤维化中发挥关键作用[36-38]。因此，本研究使用 TGF-β1 刺激人肺泡上皮细胞构建体外肺纤维化EMT 模型 。
本研究第一部分先通过 SiO2一次性气管滴注构建矽肺体内模型，通过观察小鼠体重、肺系数、肺脏大体观、HE、Masson 染色及肺组织 EMT 蛋白检测，发现在7、14 天时，矽尘模型组小鼠已形成典型的矽结节但纤维化并不明显，在第 28 天时 Masson 染色可见矽尘模型组小鼠肺部有明显蓝色胶原纤维，Western blot 检测也发现 28 天时矽尘组小鼠肺组织 Vimentin、COL I 较对照组明显增加，E-Ca 较对照组降低，而 ISL 治疗后 Masson 染色可见小鼠肺部蓝色胶原较矽尘组明显减轻，Western blot 检测发现 ISL 治疗后小鼠肺组织 Vimentin、COL I 较矽尘组降低，E-Ca 较矽尘组升高，ISL 可以抑制矽尘诱导的小鼠肺组织 EMT。第二部分的体外细胞实验也证实了 ISL 可以抑制 TGF-β1 所诱导的肺泡上皮细胞 EMT。这些结果显示 ISL 可以在体内体外水平通过抑制 EMT 进而抑制矽肺肺纤维化。
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五、结论
1.ISL 可以抑制 SiO2所致的矽肺小鼠肺纤维化；
2.ISL 可以抑制 TGF-β1 诱导肺泡上皮细胞发生 EMT；
3.ISL 可能通过 HO-1/GPX4 信号通路激活铁死亡抑制 EMT 进而抑制矽肺肺纤维化。
参考文献（略）