前 言
6-APA(6-aminopenicillanic acid，6-氨基青霉烷酸）和 7-ACA（7-aminocephalosporanicacid，7-氨基头孢烷酸）为白色的结晶粉末，两者的结构基本相似，母核结构均含有一个β内酰胺四元环，故称为β内酰胺类抗生素。6-APA 母核结构是由β内酰胺环与四氢噻唑五元环构成，6 号位的侧链为仅有一个的可以修复的化学位点（见图 1）。7-ACA 母核的结构是由内酰胺环和二氢噻嗪的六元环组成，3 位的侧链和 7 位的侧链是可以修饰的位点（见图 1）。6-APA 由青霉素的钾盐加酶后分解而成，是产生半合抗、青霉素类抗生素重要的中间过度体，是一种半抗原，与人体的物质结合后，可激活人体分泌异质性的 IgE、IgG 等抗体，引起人体过敏反应[1]。7-ACA 是先通过生物的酿制和化学方法提纯以后提取头孢菌 C，再由头孢菌 C 用化学方法分解或者用酶法分解制成 7-ACA，是头孢菌素重要的中间体，在抗生素企业工人操作过程中很容易通过呼吸道吸入而引发支气管哮喘和过敏性鼻炎[2]，也能通过皮肤接触引发皮疹和皮炎等[3-4]，严重者还可导致死亡[5]。Baldo[6]和 H usermann[7]等研究发现，制药厂的工人接触 7-ACA 所致的哮喘是由IgE 介导的变态反应，抗原决定簇与母核的构型、侧链有关，且哮喘反应类型是由侧链的结构决定的。随着对β-内酰胺类抗生素中间体导致的职业性哮喘的了解逐步提高，GBZ 57—2008《职业性哮喘诊断标准》中，已将 7-ACA 和 6-APA 确定为职业性的致喘物[8]。职业性哮喘（Occupational asthma，OA）是职业性的致喘物诱发的新发哮喘或导致的寂静性哮喘（哮喘缓解期）再发[9]。据不完全的统计，全世界现在大概有 3 亿哮喘的患者，大致估计中国约 3000 万的支气管哮喘患者，而国外的研究发现[10]，成年人的支气管哮喘中大概有 10%～15%与职业性的因素有关。当前，已经知道工作环境中存在400 多种可以诱导支气管哮喘发作的职业病危害因素，职业相关性哮喘已经成为工业化国家最常见的职业性的肺部疾病。近年国内有关制药厂β-内酰胺类抗生素导致工人哮喘的报道较多。甚至有些病例资料也显示[11]，抗生素导致职业性哮喘已成为发病率最高的职业性的致喘物。
职业接触 6-APA 和 7-ACA 所致哮喘的病理变化和临床表现与过敏性哮喘大致相同主要表现为反复发作的喘息、气急等的症状，两肺可以听到哮鸣音，其重要的病理生理特征为长期的气道炎症与气道重塑。前期以慢性炎症为主，随着病情的延长和反复的暴露会改变气道的结构，导致气道重塑。哮喘为一个长期的气道有关的炎性症疾病，它的发病机制很复杂[12-13]。其中 TH1 / TH2 类细胞因子比值的失衡是变应性哮喘形成和进展的关键性机制，哮喘发作时 TH1 型免疫减弱，TH2 型免疫异常增强，可见 TH2 型细胞在哮喘的发病机制中拥有主要的地位[14]。 TH2 型免疫反应分为速发型大的、迟发型的和运动性的哮喘[15]。当前的 TH2 型气道炎症观点认为，在早期的哮喘反应中，吸入抗原后激活肥大细胞，促进白三烯和前列腺素的释放[16,17]。在迟发性哮喘反应中是以释放白介素-4，白介素-5，白介素-13 和嗜酸粒细胞活化趋化因子为特征的，抗原通过它的提呈细胞刺激的 TH2 型细胞，接着 IgE 的同型转化，刺激嗜酸粒细胞和促进平滑肌细胞的增生[18]。气道上皮细胞产生的白介素-25 和白介素-33，引起树突状的细胞的刺激和固有淋巴细胞产生的白介素-5 和白介素-13[16,17,19]。在气道变应性反应中，IL-13 与巨噬细胞的活化[20]，嗜酸粒细胞的招募活化[21]，黏液高分泌[22]，诱生性一氧化氮合酶[23]，和成纤维细胞向纤维细胞转化致胶原堆积有关[18]。另外，IL-13 被证实在气道内直接作用于细胞可导致气道高反应[22]。相关的 TH2 型气道炎症的免疫过程见图 2。尽管该免疫过程不可能出现在所有哮喘表型，但这个途径适用于靶向治疗和潜在的生物标志物，用于预测特定治疗的反应或评估后续的治疗反应。骨膜蛋白（Periostin，PN）是一种新进发现的与支气管哮喘有关的细胞外基质蛋白（extracellular matrix protein，ECM），在哮喘气道炎症、重塑和指导预测激素治疗等方面发挥重要作用。首先，PN 经白细胞介素-4（IL-4）和 IL-13 诱导后表达[24]，参与辅助性 T 细胞 2 型免疫应答[25]，与哮喘患者气道炎性细胞浸润有关[26]。通过免疫组织分析得知，PN 沉积在上皮下纤维增厚的基膜中[27]。国外研究表明，与对照组比较，哮喘患者的 PN 基因表达会高出四倍[28]。Jia 等[29]通过检测 67 例哮喘患者的血清、诱导痰中的嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）、PN、FeNO（呼出气中一氧化氮，Fractional exhalednitric oxide）和免疫球蛋白（Immunoglobulin E，IgE）的水平，用回归模型分析发现，PN 是最能反应气道内嗜酸性炎症反应的生物学标志物。其次，作为支气管哮喘的炎症标志物可联合指导药物 lebrikizumab 的治疗，Corren 等[30]报道发现 lebrikizu- mab（IL-13的单克隆抗体）能明显降低 PN 高表达组哮喘患者的肺功能。Hanania 等[31,32]通过对高EOS 组、高 FeNO 组和高 PN 组进行研究分析发现，奥马珠单抗能明显降低高 PN 组的哮喘发作的频率，且 PN 高表达的患者接受激素治疗后能明显改善肺功能，提示 PN 较EOS、FeNO 更能准确的预测和指导哮喘治疗。再次，PN 在气道上皮细胞的表达量与基底膜厚度相关，提示其可导致气道重塑。Hoshino 等[33]通过检测哮喘患者血清 PN 和立体气道的关系，证明 PN 不仅可作为气道嗜酸性炎症的标志物还可作为气道重塑的标志物。在一般哮喘中，PN 是可以作为气道炎症和重塑的生物学标志物，参与气道嗜酸性炎症反应和上皮纤维化，那么在长期职业暴露 7-ACA 或 6-APA 工人中血清 PN 水平如何？是否可以用来反映早期气道炎症及过敏反应？可否用于预测未来发生哮喘的可能性？是否也存在气道上皮纤维化？其可能的机制如何？等目前还未见报道。
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第一部分 对象与方法
1.1 研究对象
接触组：于2015年7月至2016年8月选取山东省某抗生素生产企业职业接触7-ACA和6-APA的207 名工人为接触组，该组工人工龄均超过1.0年，且工作环境只接触7-ACA和 6-APA 粉尘，无其他粉尘接触史。接触组根据接触毒物不同分为 6-APA 接触亚组和 7-ACA 接触亚组（车间②工人主要合成 6-APA 定义为 6-APA 接触亚组，车间①③④工人主要合成和利用 7-ACA 定义为7-ACA 接触亚组）。接触组工人根据是否患有过敏性疾病（哮喘、鼻炎）分为接触发病组和接触健康者。接触组包括哮喘、接触性皮炎、鼻炎及未发病的劳动者。哮喘患者包括已在综合医院确诊为过敏性哮喘患者（过敏原为 7-ACA 或 6-APA）；职业性哮喘包括合并有变应性鼻炎或变应性皮炎的患者。职业性哮喘患者与《职业性哮喘诊断标准》（GBZ57-2008）相符。接触组中鼻炎患者包括单纯性变应性鼻炎、变应性鼻炎合并皮炎患者。对照组：选同时期体检检查结果正常、从未接触 7-ACA、6-APA 粉尘的 192 名健康工人为对照组。对照组的工人除了不接触粉尘之外，其他的职业性因素（工龄、年龄、性别等）和接触组基本的相同。所有的研究对象既往没有刺激性气体的接触史，没有结核和肺炎等呼吸系统的疾病史，并且在实验前 2 周内没有急性的呼吸道感染病史。本研究经过山东省医学科学院的医学的伦理有关委员会的批准，调查的对象都知情同意。
1.2 常用溶液配制
1N 盐酸：量取 91.5ml 的双蒸水于烧杯中，再量取 8.5ml 的浓盐酸（35%），沿玻璃棒缓慢的倒入水中，边倒边搅拌，即配成浓度为 1mol/L 的盐酸。1N 氢氧化钠：用天平秤取了 4 克 NaOH 粉末，加入双蒸馏水至 100 毫升，即配成浓度为 1 摩尔/升的氢氧化钠。洗脱液（1×）：将 50mL 洗脱液（20×）倒入 1000mL 的容器内，用双蒸馏水定容到 1000mL，混匀避免气泡产生。将其转入洗干净的玻璃瓶内，储存于 4℃冰箱内，可储存 30 天。缓冲液（1×）：将 5mL 洗脱液（20×）倒入 1000mL 的容器内，用双蒸馏水定容到100mL，混匀避免气泡产生。将液体转入洗干净的玻璃瓶内，放于 4℃冰箱内保存，可以保存一个月。Biotin-Conjugate（生物素）：用缓冲液（1×）按着 1：100 的比例稀释试剂盒提供的生物素，稀释以后 30 分钟内使用最佳。根据实验步骤的所需剂量，稀释相应的剂量。Streptavidin-HRP ：用缓冲液（1×）按着 1：100 的比例稀释试剂盒提供的酶联亲和素，稀释后 30 分钟内使用最佳。根据实验步骤的所需剂量，稀释相应的剂量。标准液：用蒸馏水按着要求将标准液粉末溶解稀释，稀释后放 10-30 分钟后使用。剩余的标准液不能储存，必须扔掉。
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第二部分 结 果...........25
2.1 接触人群现场调查和健康状况分析........25
2.2 血清 PN 水平分析...........29
2.2.1 接触组和对照组血清 PN 的含量分析........29
2.2.2 PN 与外暴露相关性分析..............30
2.3 血清 PN 与气道炎症指标相关性分析.....30
2.3.1 各组工人血清 PN、ECP 和 IgE 指标的分析......... 30
2.3.2 血清 PN、ECP、IgE 与肺功能指标 FEV1 .0相关性分析................ 32
2.3.3 血清 PN 与 EOS、ECP、IgE 相关性分析..............32
2.3.4 接尘工人血清 PN 的影响因素.......33
2.4 血清骨膜蛋白与气道重塑指标相关性分析.........34
第三部分 讨 论...........39
第三部分 讨 论
β-内酰胺类的抗生素为抗生素家族里的一个大类，包含 6-APA 结构的青霉素类和含 7-ACA 结构的头孢菌素类抗生素，两者结构基本相似，结构都有一个内酰胺四元环。青霉素的 6 位侧链与蛋白质结合，就会出现青霉素的侧链抗原决定簇。头孢菌素类 3 位侧链及 7 位侧链是可以修饰位点，7-位的 R1 取代基的侧链为主要的抗原决定簇，不容易发生交叉过敏反应。6-APA、7-ACA 是β-内酰胺类抗生素生产过程中间体，在合成和利用中间体的过程中极易通过呼吸道或皮肤进入人体，与体内物质结合在一起形成了抗原，抗原-抗体结合后引起过敏反应，引起皮肤和呼吸道过敏。致敏性药物岗位国际职业接触限制（Internal Occupation Exposure Limit,IOEL）为生产区域内的导致过敏的药物的活性物质的剩余量≤1ug/m3。英国某公司 7-ACA 的化学品安全说明书（Material SafetyData Sheet,MSDS）规定的职业接触限值是 50ug/m3（15min STEL）。但是，国内目前发布执行《工作场所空气中粉尘测定》和《工作场所有害因素接触限值》（GBZ 2.1—2007）目录中，还没有头孢菌素及青霉素药物粉尘的规定，仅在《职业性哮喘诊断标准》（GBZ57—2008），把含有 6-APA 结构的青霉素类和含有 7-ACA 结构的头孢菌素类列为职业性致喘物。关于其在人体内内暴露剂量的检测更是缺乏相关检测方法和标准。因此我们只能依据 GBZ/T 192.1—2007 检测工作场所空气中总尘（主要含 7-ACA 和 6-APA 粉尘）短时间接触浓度和各工种的总尘（主要含 7-ACA 和 6-APA 粉尘）浓度。依据《工作场所有害因素职业接触限值》（GBZ 2.1—2007）中其他粉尘的时间加权平均容许浓度（PC-TWA）8.00 mg/m3判定 CTWA是否超标。根据接触限值 16 mg/m3CSTEL是否超标。本次研究定点短时间检测发现车间①粉尘 CSTELM（P0~P100）13.41（10.74，16.10）最高，车间②、③、④粉尘 CSTELM（P0~P100）分别为 2.52（1.83，3.21）、2.84（2.07，3.61）、2.35（2.03，2.67）mg/m3；个体采样发现车间①、车间②、车间③的干燥操作工和车间④合成工粉尘 CTWAM（P0~P100）分别为 3.93（3.35~3.98）、0.48（0.40~0.53）、0.64（0.53~0.74）和 0.20（0.12~0.25）mg/m3。7-ACA 接触亚组和 6-APA 接触亚组粉尘CSTEL比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。四个车间粉尘 CSTEL进行比较差异均有统计学意义（P＜0.05），两两比较发现车间①粉尘 CSTEL与另外 3 个车间均有统计学差异（P＜0.05），车间②、③、④粉尘 CSTEL差异无统计学意义（P＞0.05）。且车间①粉尘的平均浓度均高于其他三个车间的平均浓度，故将①车间工人定义为高浓度接尘组，车间②③④车间工人合并定义为低浓度接尘组。接尘程度不同工人的血清 PN 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；个体暴露的粉尘浓度与血清 PN 之间的相关性分析显示两者存在正相关（P＜0.05），提示 PN 浓度与 7-ACA、6-APA 粉尘外暴露水平有关。可能是因为随着外暴露浓度的增加，对气道炎症损伤刺激增大，使气道内炎症细胞和炎症介质浸润增多，导致气道上皮细胞、成纤维细胞分泌 PN 含量增加，形成哮喘的可能性就会越大，因此可通过 PN 的含量可以间接了解工人哮喘发生与发展状态。
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结 论
1.职业接触 7-ACA、6-APA 可致工人血清 PN 表达升高，PN 较 ECP、IgE 更能准确的反映气道早期炎症反应，且血清 PN 与外暴露浓度相关，有作为 7-ACA、6-APA 粉尘暴露工人血清学标志物的潜能。
2.职业接触 7-ACA、6-APA 所致工人气道炎症过程中，PN 与 EOS、ECP、IgE 均呈正相关，表明 PN 参与了气道 TH2 免疫反应和嗜酸性炎症反应。
3.PN 与 MMP9、MMP2、TGF-β均呈正相关，其机制可能是通过 MMP-9 和 MMP2途径激活 TGF-β/Smad 信号通路，进而导致 7-ACA、6-APA 作业工人气道重塑。
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参考文献（略）