第一章 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
120 只 6～8 周龄 C57BL/6 SPF 级雄性小鼠，体重 18～22g，购自甘肃省兰州大学实验动物中心。实验动物许可证编号为：SCXK(甘）2018-0002。
1.1.2 药品和试剂
博莱霉素 日本东京化成工业株式会社 紫檀芪 麦克林（上海）生化科技有限公司 三氯乙醛水合物 麦克林（上海）生化科技有限公司 多聚甲醛 雷根生物技术有限公司 无水乙醇 山东烟台双双化工有限公司 异丙醇 天津登丰化学品有限公司 冰醋酸 天津富宇精细化工有限公司 EDTA 抗原修复液 Servicebio ECL 化学发光液 Servicebio 显影定影试剂 Servicebio 无酶无菌水 Solarbio
1.1.3 仪器
HH 系列数显恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限公司 全自动样品快速研磨仪 上海净信科技 冷冻高速离心机 Thermo SCIENTIFIC（美国） 超纯水机 上海和泰仪器有限公司 超微量分光光度计 Thermo SCIENTIFIC（美国） 迷你离心机 湘仪离心机仪器公司 化学发光凝胶成像系统 Proteinsimple（美国） 电泳槽 BIO-RAD（美国） 全自动酶标分析仪 BioTek（美国）
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1.2 方法
1.2.1 小鼠肺纤维化建模
建模前晚将全部小鼠禁食，称重并记录，麻醉选择 4%三氯乙醛水合物，以10ml/kg 腹腔注射。麻醉后的小鼠被固定于操作台上，仰面朝上，用碘球消毒颈部及其周围皮肤，持消毒器械剥开小鼠颈部的皮肤，使气管暴露。向气管内滴注5mg/kg 的 BLM 后立即进行复位，并将小鼠保持直立，然后左右旋转各 30 秒，最后对齐切口缝合并用无菌敷贴粘贴，在无菌条件下操作完成小鼠肺纤维化建模。以相同的方式，正常组和正常给药组给予等量的生理盐水。等待小鼠自然苏醒后自由进食水。
1.2.2 分组与给药
将 120 只 C57BL/6 雄性小鼠随机分成 4 组，每组 30 只并通过剪趾标记，即正常对照组（Control 组）、模型组（BLM 组）、正常给药组（PTE 组）、模型给药组（BLM+PTE 组）。 从建模后第 2 天起，Control 组和 BLM 组小鼠给予生理盐水，PTE 组和BLM+PTE 组小鼠给予紫檀芪 40mg/kg，每天相同时间段灌胃。
1.2.3 预实验
40 只 6～8 周龄 C57BL/6 雄性小鼠被随机分成 5 组，每组 8 只，即 Control组、BLM 组、PTE 高剂量组（40mg/kg）、PTE 中剂量组（20mg/kg）、PTE 低剂量组（10mg/kg）。除 Control 组滴注等量的生理盐水外，剩余 4 组被滴注 5mg/kg BLM 到小鼠气管内，以建立肺纤维化模型。Control 组和 BLM 组的两组小鼠给予生理盐水，剩余三组分别给予紫檀芪 40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg，每天同一时间段灌胃，持续 4 周。采集小鼠血液和肺组织标本，HE 染色用于观察小鼠肺组织的病理变化、检测小鼠中的 HYP、MPO、MDA 含量，上述结果为：对比 BLM组，高、中、低剂量紫檀芪干预后，肺纤维化程度和肺泡炎症有不同程度的降低，小鼠中的 HYP、MPO 和 MDA 含量均降低，紫檀芪高剂量组降低最显著。因此将紫檀芪 40mg/kg 确定为治疗剂量。
1.2.4 小鼠标本采集
药物干预后 7、14 和 28 天采集小鼠血液肺组织标本并保存。4%三氯乙醛水合物（10ml/kg）腹腔麻醉。用一只手固定小鼠，一手持剪刀剪去小鼠两侧的胡须。左手拇指和食指将小鼠眼部皮肤尽可能地压向颈后，使眼球向外突出，右手用弯曲的镊子取一侧眼球，用 1.5ml 离心管取血。用左手拇指轻轻按压心脏以尽可能多地收集血液，每只小鼠可采集约 0.5ml 全血，室温静置 1 小时。采用脱颈法处死小鼠。小鼠经固定消毒，打开胸腔，暴露肺部，取出肺组织，用冰盐水洗涤，然后用滤纸吸干后称肺湿重，将右肺置于 1.5ml 离心管中，-80 ℃的冰箱储存。将左肺置于 1.5ml 离心管中，然后加入 4%多聚甲醛固定左肺。
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第二章 结果
2.1 各组小鼠一般情况
Control 组和 PTE 组的小鼠活跃、反应迅速、精神健康状况良好、饮食正常、毛发顺滑有光泽、体重呈增长趋势，这两组小鼠均无死亡。BLM 组小鼠活动迟缓、反应迟钝、抱团、精神状态差、饮食减少、毛发枯燥并掉毛、体重呈下降趋势，部分小鼠口唇紫绀，死亡 3 例，死亡时间分别为建模后第 8 天、12 天、26天。BLM+PTE 组小鼠在第一周时活动减少、反应差、抱团、精神状态较差、饮食减少、毛发稍枯、体重下降，从第二周开始情况好转，活动增多，精神状态、饮食、毛发较前好转，死亡 2 例，死亡时间分别为建模后第 15 天、26 天，死亡数目少于模型组。
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2.2各组小鼠肺组织病理学变化
2.2.1 HE 染色
观察各组小鼠肺组织切片 HE 染色，建模后 7、14 和 28 天 Control 组和 PTE组小鼠肺组织病理学变化没有显著性差异，Control 组小鼠的肺组织结构清晰可见，无损伤，肺泡壁没有明显增厚，炎症性细胞少许，间质性纤维组织没有显著增殖。PTE 组的小鼠肺组织结构清楚，肺泡壁组织无明显增厚，炎症细胞少量，间质性纤维组织无明显增生。建模后 7 天 BLM 组小鼠肺组织结构出现病理异常，包括炎症细胞浸润、肺泡隔膜变厚、水肿和纤维细胞增生；建模后 14 天 BLM 组小鼠肺组织结构明显受损及构架明显紊乱，大量的炎症细胞浸润，肺泡壁明显水肿增厚和纤维细胞明显增生；建模后 28 天小鼠肺组织结构严重受损及构架严重紊乱，肺泡几乎被纤维团覆盖，有大量胶原沉积。紫檀芪治疗后 7、14 和 28 天肺组织损伤、肺泡炎症和纤维化程度降低。见图 3-1 所示。
肺损伤评分采用 Koksel 等方法进行评定[47]。评分为 4 个等级，1 表示正常肺组织，2 表示少量中性粒细胞浸润，3 表示中性粒细胞中度浸润，血管周围水肿形成和肺部结构部分破坏，4 表示大量中性粒细胞浸润，完全破坏肺部结构。建模后 7、14 和 28 天，对比 Control 组，BLM 组小鼠肺组织损伤显著增加（P＜0.01），均具有统计学差异；对比 BLM 组，BLM+PTE 组小鼠肺组织损伤明显降低（P＜0.05），均具有统计学差异；Control 组和 PTE 组不具有统计学差异（P＞0.05）。见图 3-2（D、E、F）所示。
此外，肺纤维化通过改良的 Ashcroft 评分进行量化[48]。建模后 7、14 和 28天，对比 Control 组，BLM 组小鼠肺组织纤维化评分明显升高（P＜0.01），均具有统计学差异；对比 BLM 组，BLM+PTE 组小鼠肺组织纤维化评分显著下降（P＜0.05），均具有统计学差异；Control 组和 PTE 组不具有统计学差异（P＞0.05）。见图 3-2 所示（A、B、C）所示。
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第三章 结果 ............................................ 23
3.1 各组小鼠一般情况 ........................................... 23
3.2各组小鼠肺组织病理学变化 ................................... 23
3.3 各组小鼠肺组织 MPO、HYP、MDA 和 T-SOD 含量的变化 ........ 26
第四章 讨论 ............................... 37
第五章 结论 ................................ 41
第四章 讨论
肺纤维化是一种肺间质性疾病，其特征以肺间质慢性炎症和进行性纤维化[49]。近年来，肺纤维化的发生率持续上升，预后差，死亡率高[50]。肺纤维化的原因包括自身免疫性疾病、病毒感染、放化疗、移植物抗宿主病或雾化环境毒素，但在大多数情况下，疾病的病因仍然未知（如 IPF）[51]。IPF 既是最常见的肺纤维化类型也是最严重的肺纤维化间质性肺疾病[52]。肺纤维化的进展是由肺泡上皮细胞对各种刺激的损害而引发的，受损的肺泡上皮细胞可诱导并分泌多种细胞分子[53]，这些细胞分子可以通过刺激间充质细胞的增殖，吸引和募集肺成纤维细胞，刺激EMT，从而诱导肺成纤维细胞和肌成纤维细胞的聚集，后者分泌大量胶原蛋白[54]，从而导致功能性肺实质被纤维组织替代会逐渐损害氧合作用和气体交换，血液供氧减少，最终导致呼吸衰竭而死亡[55]。尽管两种抗纤维化药物吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（nintedanib）可以减缓肺功能下降[56]，然而它们的副作用如胃肠道功能紊乱和肝功能障碍，往往会导致治疗中断[57,58]。另外，IPF 晚期患者使用吡非尼酮治疗效果不佳[59]。肺移植仍然是唯一可以通过将死亡风险降低到 75%来显著提高患者预期寿命的替代疗法，但由于肺移植的禁忌症，可能仅适用于少数 IPF 患者[60]。因此，找寻对肺纤维化治疗具有有效、经济及副作用少的药物至关重要。
紫檀芪属于白藜芦醇的二甲基类似物，天然存在于蓝莓和紫檀木中，是蓝莓的主要抗氧化剂成分，可能具有许多预防特性和治疗靶点，如心血管、神经、代谢、致癌和细菌性疾病等[61]。它具有抗炎、抗氧化、抗癌和抗肥胖等作用。紫檀芪体内存在两个甲氧基基团，而白藜芦醇体内不存在甲氧基基团，因此二者相比，紫檀芪的亲脂性和口服吸收性增加，从而使其具有更高的生物可用性[62]，并可能有助于获得更有价值的临床效果。本研究旨在探讨紫檀芪对 BLM 诱导的小鼠肺纤维化的作用，以及 TLR4-MyD88-NF-κB 信号通路在肺纤维化发病过程中的作用，以期为临床用药提供参考。
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第五章 结论
5.1 主要结论
1.紫檀芪可降低 BLM 诱导小鼠肺纤维化肺组织中 MPO 活性，抑制血清中TNF-a 和 IL-6 水平，减轻肺部炎症，延缓肺纤维化的进展。
2.紫檀芪可降低 BLM 诱导小鼠肺纤维化肺组织中 MDA 含量，提高 T-SOD含量，抑制氧化应激，减轻肺损害，延缓肺纤维化的进展。
3.紫檀芪可减低 BLM 诱导小鼠肺纤维化肺组织中 HYP 含量，减少胶原沉积，减轻肺纤维化。
4.紫檀芪干预后 BLM 诱导小鼠肺纤维化肺组织中 a-SMA、Vimentin 和Collagen I 的表达水平降低,肺组织中 E-cadherin 的表达水平升高,肺泡上皮细胞受保护，间质细胞增生受抑制，成纤维细胞减少，EMT 过程受抑制，改善肺纤维化。
5.紫檀芪可调节 TLR4-MyD88-NF-κB 信号通路，减轻肺部炎症，抑制胶原沉积，预防和治疗肺纤维化。
参考文献（略）