引言
近年来，鼻咽癌的发病率日益增多，该病有一定的地域性，在世界范围内，中国是发病率最高的区域，尤其是广东地区，故又称为“广东癌”。其发病原因或是EB病毒感染，或是饮食、生活习惯等因素引起。鼻咽癌的治疗首选放射疗法，然而由于鼻咽癌解剖位置较深，邻近结构复杂，早期易出现淋巴和远处转移，其5年生存率徘徊在50%左右，晚期更低至10%-40%。田道法教授经过多年临床经验研制出的益气解毒方可协同放疗提高抗癌效应⑴，明显减轻放疗的副反应，提高患者免疫力，防止鼻咽癌转移和复发。前期研究表明，该方在临床上能有效抑制鼻咽癌[2]，体内能抑制鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤和复种移植瘤的生长和成癌率[3]，体外对鼻咽癌细胞有显著的杀伤效应[4]。肿瘤细胞中存在少数具有自我增殖和多向分化潜力的细胞，即肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSCs),它与肿瘤的发生、发展、转移等密切相关。虽然肿瘤干细胞在肿瘤细胞中只占很小的比例，但这可能是肿瘤的初始细胞[5],这部分细胞的控制是以后肿瘤治疗的关键。目前抗癌药物主要通过细胞毒性而发挥作用，这种细胞毒性只对正常的肿瘤细胞有效，由于关键的干细胞存在并且可以不断分化为新的肿瘤细胞，故肿瘤治疗效果不甚理想，而抑制或杀死肿瘤干细胞成为抗癌药物研究的热点。细胞的死亡形式，除了细胞毒的坏死外还有一种程序性的死亡，即洞亡。调亡对正常状态下机体本身的平衡起着重要的作用，一旦细胞调亡出现异常将会导致疾病的发生，常见的细胞调亡抑制在肿瘤的发病机制研究中占有重要的地位，目前临床上的放射治疗和化学治疗主要通过诱导细胞调亡产生疗效，近年来对于调亡的研究取得了很大的进展，然而对于其机制的研究有待进一步深入。
然而干细胞可以通过多种方法进行分离提取，其中无血清悬浮培养的方法即配制不含血清的培养基，加入特定的生长因子，培养一段时间后，绝大多数肿瘤细胞由于缺乏生长必须的血清而停止生长，甚至死亡，而肿瘤干细胞却可以在这样的环境中悬浮生长，最终形成肿瘤干细胞球。这种方法对设备要求低，操作简单且相对稳定，因此我们选用这种方法来提取分离CNE2干细胞。然而对于这部分细胞仍需进一步的鉴定是否具有干性特征。研究表明，很多天然药物成分可以抑制肿瘤干细胞，发现姜黄素可以抑制乳腺癌细胞的形成。大豆异黄酮能诱导肿瘤干细胞洞亡[7]。番莉红素可以抑制结肠癌细胞增殖[8]。因此我们有望从中药这个天然宝库中寻找到有效抑癌抗癌的药物。古往今来，中药多以从这个思路出发，结合现代技术对于干细胞的研究，希望在传统的药方里面有新的发现，在此基础上为中药复方体外干预干细胞的生长的研究尽献绵薄之力。益气解毒方的研究开展了二十几年，从干细胞角度进行的研究还是一块空白，由于中药方剂中各种药物有效成分的复杂性及药物作用的不同途径等原因，深层次、高水平的研究有一定的局限，衷心对以田道法教授为中心的湘雅研究团队和湖南中医药研究团队付出的努力表示深深的敬意及尊重。以往的初步试验研究认为，本方具有诱导鼻咽癌调亡的作用，本实验首次从干细胞给药干预的角度研究本方对于鼻咽癌CNE2侧群细胞诱导凋亡的效应及作用机制。本研究将为鼻咽癌CNE2肿瘤细胞中干性细胞的分离及鉴定提供方法借鉴，可进一步阐明益气解毒方的作用和机制，为寻找肿瘤干细胞的新範点和临床蹄选新的抗肿瘤药物提供基础，为肿瘤防治研究提供一条新途径。
………..
第一部分材料与方法
1实验材料
1.1药物
益气解毒方组成：黄苗20g党参l0g天花粉l0g白花蛇舌草20g茯苳l0g甘草6g黄连lOg由湖南中医药大学第一附属医院提供，经鉴定为药物成分完全的道地药材。
1.2细胞
中南大学湘雅中心实验室细胞库提供的生长良好、生殖力旺盛的人鼻咽癌细胞CNE2细胞株。
……..
2实验方法
2.1 CNE2细胞培养
2.1.1细胞复苏及换液
取出冻存管，于37°C水浴箱中快速解冻，待冻存液完全溶解后转入超净台中，将细胞移入15ml离心管中，1000rpin><5niin离心，去上清，加入1ml完全培养基，混悬，移入培养瓶中，补足完全培养基至6ml,摇匀，常规细胞培养，细胞融合度为80%-90%换液，吸去旧培养液，用PBS清洗2次，加入完全培养基，放入培养箱中继续培养。
2.1.2细胞传代
细胞处于对数生长期时，弃去培养基，用2mlPBS清洗细胞2次，加入0.25%胰酶约1ml，以胰酶铺满培养瓶底为准，待细胞变圆，细胞间隙扩大之后，加入2nil完全培养基终止消化，打勾，按1:2种入新培养瓶中，补足培养基至6ml继续培养。
2.1.3细胞冻存
当细胞处于对数生长期时，吸除培养基，用PBS液清洗2次，胰酶消化，加入2ml培养基打勾细胞，转入到15ml离心管中，1000rpmx5inin离心，去上清收集细胞，用冻存液重悬细胞，将细胞悬液分装至冻存管中，每管2ml,标记细胞种类、冻存日期、用梯度降温方法进行冻存。
……..
第二部分结果与分析........ 11
1CNE2侧群细胞（CNE2-SP)的分离与初步鉴定....... 11
1.1悬浮分离干细胞的结果....... 11
1.1.1干细胞的形态观察....... 11
1.1.2台盼蓝染色干细胞的观察....... 13
1.2 CNE2-SP细胞自我更新能力....... 15
1.3 CNE2-SP细胞的分化潜能....... 15
1.4 CNE2-SP细胞的耐药性....... 15
1.5 CD44的表达情况....... 15
2益气解毒方对CNE2-SP细胞增殖活性的影响....... 16
3益气解毒方诱导CNE2-SP细胞凋亡的研究....... 17
3.1 CNE2-SP细胞荧光染色的凋亡情况....... 17
3.1.1细胞凋亡的形态学观察....... 17
3.1.2细胞凋亡率的变化.......18
3.2凋亡相关蛋白的表达....... 19
第三部分讨论....... 20
第四部分结论....... 25
第三部分讨论
中医学里面没有鼻咽癌的名称，其临床表现属于“鼻渊”、“真头痛”、“上石疽”等的范畴。其病因病机为“胆经之热移于脑髓，风寒凝郁火邪”。由此可见，该病多因与毒邪之气久郁体内密切相关，因病位较深，早期很难发现，故治疗效果很不理想。中医发现该病“药石无功，针灸难效，万死一生，害人甚速”，仍总结出了很多预防治疗该病的方法，可以有效控制其发展，延长病人生存期，提高病人生活质量。临床研究发现，鼻咽癌的发生与机体内外各种致病因素有关，尤其是先天禀赋不足，正气虚弱，脏腑功能失调，邪毒乘虚而入；同时易出现气血凝滞，后发展为热毒郁结体内，肿块逐渐增大，脏腑日渐亏虚，气阴两伤，终因正气衰败而亡。中医体质类型与鼻咽癌的发生有很大的关系，其中气虚质和以气虚为基础的其他体质类型较为突出[12]。《黄帝内经》有论述“正气存内，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”《外证医案》有曰“正气虚则成岩（癌）”。体质虚弱，正气不足以抵抗病毒入侵，以致EB病毒乘势入侵而影响机体，成为鼻咽癌的高危人群。可见气虚质是鼻咽癌发病的主要内因并贯穿发病的始终，因此提出“气虚染毒"的理论，并在此基础理论指导下创立“益气解毒方”。经临床证实，该方对于鼻咽癌放疗具有明显的增敏减毒效应，并能提高机体的免疫力。该方为本课题组针对鼻咽癌研制的一个有效方药（经湖南省药监局批准，通过GPP验收），由黄苗20g党参l0g天花粉l0g白花蛇舌草20g夜等l0g甘草6g黄连l0g组成，具有益气解毒,生津润燥的功效。全方重用益气药物黄苗和党参，补益正气，同时鼓邪外出，为全方的基础。臣以黄连、白花蛇舌草清热解毒，祛除癌毒，与补气之品同用，体现攻补兼施的原则，同时佐以天花粉、获苳健脾养阴，与黄苗、党参相制为用，达到阴阳平调。甘草调和诸药，为佐使药。全方补湾并用，扶正柱邪，改善患者气虚体质，同时解毒养阴，起到平和抗癌的作用。本实验选用水提取的方法制作益气解毒方的浓缩粉末，方法同临床方药的煎煮，最大程度模拟临床给药方式，保证得出的实验结果最接近于实际疗效。但是由于时间的原因，仅仅从体外做了一系列的研究，药物的提取成分直接作用于人鼻咽癌CNE2 (CNE2-SP)细胞，体内生物化学代谢的缺失使得药效有可能偏离原来的作用水平而被放大，从而其临床实际意义有待进一步探讨。
……….
结论
益气解毒方能有效抑制CNE2-SP细胞的增殖活性，并诱导其凋亡，机制或为引起DNA损伤，启动内源性（线粒体）途径。益气解毒方对CNE2-SP细胞进行干预，其有效作用主要是通过诱导细胞调亡完成，机制可能是益气解毒方能引起CNE2-SP细胞DNA损伤，诱导P53表达上调，启动内源性线粒体途径诱导细胞凋亡。然而本实验研究还存在某些不足之处，比如缺失的体内实验研究更接近真实的人体生物代谢环境，这个角度的研究能加强科研与临床的联系，为今后该方的正确应用提供实验基础；IE向治疗取得了一定的进步，然而可靠的临床模型的缺失极大的削弱了紀向治疗的潜力》以后的实验研究可根据中医辨证分型，在"气虚染毒”动物模型的基础上研究该方对干细胞的抑制或杀灭作用，同时更能体现中医“辨证论治”的特色。在将来对于本复方的研究中，或通过构成药物有效成分的提取，使用最新药理学技术，研究药物的交互协同作用，发现其抗肿瘤範点，为新药的开发做出更大的贡献。或在原有药物的基础上加减药物，进行本方的创新研究，扩大本方的临床应用范围；另外，除了诱导调亡外，本方或从其他方面杀死CNE2-SP细胞，比如通过激活某条通路，应从多方面开展机制研究，为中药有效的抗肿瘤作用提供坚实的理论基础。
............
参考文献（略）