第 1 章 文献综述
1.1 Bcl-2 蛋白家族
1.1.1 Bcl-2 蛋白家族在凋亡中的作用
Bcl-2 蛋白家族最初的发现，是在分析 B 细胞滤泡型淋巴瘤时，发现（ t14-18）染色体易位断裂，随着研究的不断深入，后来发现这个家族有 20 个成员。所有的 Bcl-2 家族蛋白至少包含了一个保守 α-螺旋基序，即 Bcl-2 同源（BH）区域：BH1、BH2、BH3 和 BH4。根据功能的不同，这个家族成员进一步被分为三类。第一类是抗凋亡蛋白，包含着4个BH区域，这些蛋白包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Bcl-B 和 A1。而第二类和第三类同样都具有促凋亡的功能，它们都属于促凋亡蛋白：一种是多 BH 区域蛋白，包含着 3 个 BH 区域，即 Bax、Bak 和 Bok 蛋白；另一种是 BH3-only 蛋白，包括 Bad、Bid、Bim、Bmf、Bik、Hrk、Noxa 和 Puma，这些蛋白只有 BH3 区域，通过它们的 BH3 区域能与 Bcl-2蛋白结合，抑制 Bcl-2 蛋白抗凋亡活性，从而促进凋亡的发生（表 1.1）。
由多 BH 区域组成的 Bcl-2 和 Bcl-xL 蛋白，它们的分子表面形成一个疏水结构，而由 BH1、BH2 和 BH3 区域组成了一个 BH3 结合环，这个 BH3 结合环可以调节促凋亡蛋白的 BH3 区域，从而活化 BH123 蛋白（即促凋亡蛋白）或者中和 BH1234 蛋白（即抑凋亡蛋白）。在凋亡刺激的时候，Bax 和 Bak 转移到线粒体膜上，形成多聚体孔道，从而便于细胞色素 c 从线粒体内膜释放到胞浆中。只有 Bcl-xL 和 Mcl-1（不包括 Bcl-2）能与 Bak 靶向结合，而所有的抗凋亡蛋白成员都能与 Bax 结合抑制凋亡（图 1.1）。无论是促凋亡蛋白还是抗凋亡蛋白，组成它们的氨基酸都具有易变性，这样更有利于促凋亡蛋白的 BH3 区域与抗凋亡蛋白可变区域相互结合。在 Bcl-2 蛋白家族中，改变一个BH3 区域就会影响很多与之相互结合的蛋白，从而影响整个 Bcl-2 蛋白家族网络。
Bcl-2 蛋白家族调节凋亡主要是通过调节线粒体膜。严格上来说，抗凋亡多区域蛋白，例如 Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 和 Mcl-1 主要驻留在线粒体膜上，当线粒体膜发生透化作用（Mitochondrial membrane permeabilization，MMP）时，保护线粒体膜的稳定性，从而限制凋亡事件的发生。除此之外，在细胞质中也存在着抗凋亡蛋白，这些抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白相互结合，抑制促凋亡蛋白向线粒体移动。有研究发现 Bak 是与线粒体外膜相关的一个蛋白，而 Bax 在正常细胞中存在于胞质中，当细胞受到凋亡刺激或诱导的时候，Bak 和 Bax 这两个主要的促凋亡蛋白通过其多 BH 区域与 MMP 结合。之前也有文献对于MMP 也进行了详尽的研究，当细胞线粒体膜通透性发生改变时，Bak 和 Bax的构象会发生改变，暴露其 N-末端，从而插入线粒体膜上形成同源二聚体，进而形成巨大的蛋白孔道。进而促发了细胞色素 c 从线粒体内释放入胞浆，在胞浆内激活 Caspase-3 和 Caspase-7，从而导致内源性凋亡的活化。
1.1.2 Bcl-2 蛋白与肿瘤耐药
目前肿瘤是威胁人类健康的一个重要问题，主要的治疗手段包括手术、放疗和不同药物联合化疗，根据不同的肿瘤选择一种或多种治疗方法，就目前的情况看，化疗成为主要的治疗手段。然而，化疗面临着两大难题，一是化疗药物特异性差，其药物的损害作用也会攻击周围的正常组织，从而带来更大的损伤；另一大难题就是化疗过程中肿瘤细胞对于化疗药物产生原发性或继发性的耐药，一旦产生耐药，如果仅仅是通过增加药物剂量来达到治疗肿瘤，不但使得周围健康器官进一步被损害，也会使得细胞对药物更加耐药。因而解决肿瘤耐药问题刻不容缓。
既往对肿瘤耐药研究发现，肿瘤耐药主要与以下分子机制有关：多药耐药基因（Multidrug Resistance, MDR）的高表达、凋亡不足、DNA 损伤修复能力增强和 drug transport 等信号途径有关。然而随着研究的深入 Bcl-2 等抗凋亡蛋白的高表达导致肿瘤细胞凋亡逃逸被认为是另一个主要机制。
第 1 章 文献综述 ...........1
1.1 BCL-2 蛋白家族 ...........1
1.1.1 Bcl-2 蛋白家族在凋亡中的作用 ...........1
1.1.2 Bcl-2 蛋白与肿瘤耐药 ...........3
1.1.3 以 Bcl-2 蛋白为靶点的抑制剂 ...........4
1.1.4 小分子化合物 S1 ...........6
1.2 内质网应激 ...........7
1.2.1 概述...........7
1.2.2 内质网应激反应的主要信号通路 ...........8
1.2.3 内质网应激介导的细胞凋亡 ...........9
1.2.4 Bcl-2 蛋白与内质网应激 ...........10
1.3 自噬 ...........12
1.3.1 概述...........12
1.3.2 Bcl-2 蛋白参与调节自噬 ...........13
1.3.3 Bcl-2 蛋白家族调控内质网应激和自噬 ...........13
第 2 章 实验部分 ...........17
2.1 S1 通过线粒体途径诱导人卵巢癌细胞凋亡...........17
2.1.1 前言...........17
2.1.2 材料和方法 ...........19
2.1.3 实验结果 ...........24
2.1.4 讨论...........29
2.1.5 小结...........31
2.2 内质网应激在 S1 诱导人卵巢癌细胞凋亡中的作用...........31
2.2.1 前言...........31
2.2.2 材料和方法 ...........32
2.2.3 实验结果 ...........33
2.2.4 讨论...........46
2.2.5 小结...........47
2.3 自噬在 S1 诱导人卵巢癌耐药细胞内质网应激介导的凋亡中的作用...........47
2.3.1 前言...........47
2.3.2 材料和方法 ...........50
2.3.3 实验结果 ...........50
2.3.4 讨论...........62
2.3.5 小结...........64
结 论:
1.小分子化合物 S1 通过抑制人卵巢癌细胞 SKOV3 及其顺铂耐药株SKOV3/DDP 细胞 Bcl-2 蛋白表达，诱导细胞发生线粒体凋亡途径。
2.S1 能够诱导人卵巢癌细胞内质网应激介导的细胞凋亡，SKOV3/DDP 细胞内质网应激活化时间晚于 SKOV3 细胞。
3.S1 作用早期通过干扰 Bcl-2 蛋白与 Beclin-1 蛋白的相互作用，活化耐药细胞株 SKOV3/DDP 细胞自噬，活化的自噬清除泛素化的错误折叠蛋白，S1 作用晚期，自噬活化减弱。
4.抑制 SKOV3/DDP 细胞自噬，增强 S1 诱导的内质网应激，使内质网应激介导的细胞凋亡活化增强，表明在耐药细胞中活化的自噬减轻细胞内质网应激介导的细胞凋亡。
5.S1 能诱导 SKOV3/DDP 细胞 JNK 信号通路的活化，活化的 JNK 促进耐药细胞内质网应激介导的细胞凋亡。
参考文献
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