1.TGF-β1信号通路与肾纤维化
1.1.TGF-β1结构与功能
转化生长因子（transforming growth factor β，TGF-β）在调控细胞分裂增殖和分化等方面具有重要作用，在哺乳动物组织中 TGF-β 分为 TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 三种亚型，TGF-β1 主要在肾脏中分布，TGF-β1 主要经其受体发挥作用。TGF-β 受体主要有三种：TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）、TGF-βⅡ型受体（TβRⅡ）、TGF-βⅢ型受体（TβRⅢ）[21]。研究已经显示 TGF-β 信号传导在肾纤维化中作为有效的纤维发生诱导物发挥关键作用[22-23]。
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三、前言......................61.1.TGF-β1结构与功能
转化生长因子（transforming growth factor β，TGF-β）在调控细胞分裂增殖和分化等方面具有重要作用，在哺乳动物组织中 TGF-β 分为 TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 三种亚型，TGF-β1 主要在肾脏中分布，TGF-β1 主要经其受体发挥作用。TGF-β 受体主要有三种：TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）、TGF-βⅡ型受体（TβRⅡ）、TGF-βⅢ型受体（TβRⅢ）[21]。研究已经显示 TGF-β 信号传导在肾纤维化中作为有效的纤维发生诱导物发挥关键作用[22-23]。
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1.2.TGF-β1信号通路与肾纤维化
研究表明，TGF-β1 通过 TGF-β1/Smads 信号通路调节基因转录[24-26]。多种肾脏疾病伴肾纤维化过程中，都伴随着 TGF-β1/Smad 信号传导通路的活化[27-28]。Smad 依赖性信号转导途径是 TGF-β1 诱导的纤维化最经典的信号传导途径之一[29-31]。Smad 途径是通过细胞膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体 I、II 调节物完成的，II 型受体与 TGF-β1 结合并激活后，使 I 型受体磷酸化，激活后的 I 型受体使 Smad2、3 发生磷酸化，胞浆中的 Smad4与激活后的 Smad2、3 相结合进入细胞核，激活的 Smad 与基因转录刺激物相作用发挥生物效应。许多研究表明 Smad2、Smad3 的缺失可延缓肾纤维化的进展 [32-34]，而 Smad7 的缺失则导致肾纤维化加重。许多肾脏疾病模型中 Smad7 的过度表达可抑制肾纤维化[35-39]。Smad3 在肾纤维化中高度活化[40-41]和 Smad3 敲除在肾脏疾病动物模型中减弱肾纤维化[42]。Smad6、7 可竞争性与 TGF-β1Ⅰ型受体结合，抑制 TGF-β1Ⅰ型受体对 Smad2、3 的磷酸化，阻断信号传导。Smad3 磷酸化的选择性抑制剂（SIS3）已被证明可改善糖尿病肾病的肾纤维化。研究证实 SIS3 可抑制 TGF-β1 诱导的纤维化基因表达[43]。
研究表明，TGF-β1 通过 TGF-β1/Smads 信号通路调节基因转录[24-26]。多种肾脏疾病伴肾纤维化过程中，都伴随着 TGF-β1/Smad 信号传导通路的活化[27-28]。Smad 依赖性信号转导途径是 TGF-β1 诱导的纤维化最经典的信号传导途径之一[29-31]。Smad 途径是通过细胞膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体 I、II 调节物完成的，II 型受体与 TGF-β1 结合并激活后，使 I 型受体磷酸化，激活后的 I 型受体使 Smad2、3 发生磷酸化，胞浆中的 Smad4与激活后的 Smad2、3 相结合进入细胞核，激活的 Smad 与基因转录刺激物相作用发挥生物效应。许多研究表明 Smad2、Smad3 的缺失可延缓肾纤维化的进展 [32-34]，而 Smad7 的缺失则导致肾纤维化加重。许多肾脏疾病模型中 Smad7 的过度表达可抑制肾纤维化[35-39]。Smad3 在肾纤维化中高度活化[40-41]和 Smad3 敲除在肾脏疾病动物模型中减弱肾纤维化[42]。Smad6、7 可竞争性与 TGF-β1Ⅰ型受体结合，抑制 TGF-β1Ⅰ型受体对 Smad2、3 的磷酸化，阻断信号传导。Smad3 磷酸化的选择性抑制剂（SIS3）已被证明可改善糖尿病肾病的肾纤维化。研究证实 SIS3 可抑制 TGF-β1 诱导的纤维化基因表达[43]。
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2.BMP-7 信号通路与肾纤维化
2.1.BMP-7 结构与功能
BMP-7 的表达主要定位于肾脏及骨组织中，尤其在哺乳动物的肾小管中高度表达。BMP-7 基因位于 20q13.31 染色体位点，编码成熟的带有 7 个外显子的 4.0kb m RNA 转录物，翻译成 431 个氨基酸的蛋白质。BMP-7 是肾单位数量和大小的决定性因素[64]。研究表明，在肾脏保护方面，BMP-7 对维护肾脏生理结构和功能发挥重要作用[65-66]。BMP-7 主要在皮质和髓质近端肾小管细胞、远曲小管、集合管上皮细胞和肾小球足细胞中表达。此外，肾血管的外膜中和输尿管的上皮细胞中均发现 BMP-7 表达较丰富[67]。BMP-7 受体主要包括丝/苏氨酸蛋白激酶受体Ⅰ型以及Ⅱ型[68]，主要通过 BMP-7/Smads信号传导通路来发挥生理作用。BMP-7 缺失小鼠在出生后不久即死亡，与肾发育不全及肾输尿管芽分支减少、肾间质丢失、肾功能停止和肾小球密度明显减少有关。人类有三种 I 型 BMP 受体 BMPR-IA（Alk3）、BMPR-IB（Alk6）和 IA 型激活素（Alk2）受体，它们与激活素和 TGF-β 以及 BMPs 结合。
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2.1.BMP-7 结构与功能
BMP-7 的表达主要定位于肾脏及骨组织中，尤其在哺乳动物的肾小管中高度表达。BMP-7 基因位于 20q13.31 染色体位点，编码成熟的带有 7 个外显子的 4.0kb m RNA 转录物，翻译成 431 个氨基酸的蛋白质。BMP-7 是肾单位数量和大小的决定性因素[64]。研究表明，在肾脏保护方面，BMP-7 对维护肾脏生理结构和功能发挥重要作用[65-66]。BMP-7 主要在皮质和髓质近端肾小管细胞、远曲小管、集合管上皮细胞和肾小球足细胞中表达。此外，肾血管的外膜中和输尿管的上皮细胞中均发现 BMP-7 表达较丰富[67]。BMP-7 受体主要包括丝/苏氨酸蛋白激酶受体Ⅰ型以及Ⅱ型[68]，主要通过 BMP-7/Smads信号传导通路来发挥生理作用。BMP-7 缺失小鼠在出生后不久即死亡，与肾发育不全及肾输尿管芽分支减少、肾间质丢失、肾功能停止和肾小球密度明显减少有关。人类有三种 I 型 BMP 受体 BMPR-IA（Alk3）、BMPR-IB（Alk6）和 IA 型激活素（Alk2）受体，它们与激活素和 TGF-β 以及 BMPs 结合。
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2.2.BMP-7 与肾纤维化
BMP-7 在急性和慢性肾损伤模型中具有肾保护作用，包括缺血再灌注损伤（IRI）、单侧输尿管梗阻、5/6 肾切除、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等。BMP-7 在其他纤维化疾病中是有效的，包括心脏、肝、角膜和二氧化硅诱导的肺纤维化。肾脏发育不全与机体缺乏 BMP-7 相关，BMP-7 可阻断 TGF-β1 引起的表型转化及肾脏纤维化。多种急慢性肾脏损伤模型如：单侧输尿管梗阻大鼠模型[69]、糖尿病肾病大鼠模型[70-71]等，与正常组织相比，BMP-7 表达减少。研究证实外源重组 BMP-7 对阻塞性肾脏损伤具有保护效应[72]。BMP-7 抗肾脏纤维化的机制有多种：（1）BMP-7 可抑制 TGF-β1 的产生，并阻断 TGF-β1 信号传导通路。有研究证实，人重组 BMP-7 蛋白可阻断 TGFβ1 诱导上皮间质转化的过程，主要是遏制 TGF-β 激活 Smad-2/3，BMP-7 与其受体结合后促进 Smad-1/5/8 的磷酸化，引起 TGF-β 信号传导通路中断[73-74]。Scott 等人的研究发现骨形态发生蛋白-7-Smad1/5/8 途径促进阻塞性损伤后的肾脏修复过程[75]。研究表明：TGF-β1 在输尿管梗阻动物模型中表达增加，使用 BMP-7 治疗可明显减少 TGF-β1 的表达 [76]。在系膜细胞中同时加入 BMP-7 和 TGF-β1 孵育，结果表明 TGF-β1 诱导的致纤维化因子表达显著减少[77]。而 Yu 也发现 BMP-7 可以减弱 TGF-β1 诱导的 NRK-52E 细胞凋亡。（2）激活细胞外基质（ECM）降解途径。增加 BMP-7 表达能够促进细胞外基质降解，减少多种促炎症因子，对肾纤维化具有预防和治疗作用[78-79]。MMP-2 在 ECM 的降解过程中十分重要，TGF-β1 可抑制 MMP-2 的活性及功能，而 BMP-7 可恢复 MMP-2 的表达及功能活性。（3）减少多种促炎症因子的表达。还有学者发现，在炎症反应及免疫应答过程中 BMP-7 发挥重要作用，其在心、肾等各种脏器中的作用已有明确报道[80]。Li 研究结果表明 BMP-7 通过抑制氧化应激和包括 p38 和 p44/42 MAPK 在内的多种炎症信号通路来抑制糖尿病肾病中的管状促炎反应[81]。研究证明 BMP-7 通过上调张力蛋白同系物（PTEN）特异性抑制肾集合管和肾小管上皮细胞中 TGF-β1 表达[82]。
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BMP-7 在急性和慢性肾损伤模型中具有肾保护作用，包括缺血再灌注损伤（IRI）、单侧输尿管梗阻、5/6 肾切除、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等。BMP-7 在其他纤维化疾病中是有效的，包括心脏、肝、角膜和二氧化硅诱导的肺纤维化。肾脏发育不全与机体缺乏 BMP-7 相关，BMP-7 可阻断 TGF-β1 引起的表型转化及肾脏纤维化。多种急慢性肾脏损伤模型如：单侧输尿管梗阻大鼠模型[69]、糖尿病肾病大鼠模型[70-71]等，与正常组织相比，BMP-7 表达减少。研究证实外源重组 BMP-7 对阻塞性肾脏损伤具有保护效应[72]。BMP-7 抗肾脏纤维化的机制有多种：（1）BMP-7 可抑制 TGF-β1 的产生，并阻断 TGF-β1 信号传导通路。有研究证实，人重组 BMP-7 蛋白可阻断 TGFβ1 诱导上皮间质转化的过程，主要是遏制 TGF-β 激活 Smad-2/3，BMP-7 与其受体结合后促进 Smad-1/5/8 的磷酸化，引起 TGF-β 信号传导通路中断[73-74]。Scott 等人的研究发现骨形态发生蛋白-7-Smad1/5/8 途径促进阻塞性损伤后的肾脏修复过程[75]。研究表明：TGF-β1 在输尿管梗阻动物模型中表达增加，使用 BMP-7 治疗可明显减少 TGF-β1 的表达 [76]。在系膜细胞中同时加入 BMP-7 和 TGF-β1 孵育，结果表明 TGF-β1 诱导的致纤维化因子表达显著减少[77]。而 Yu 也发现 BMP-7 可以减弱 TGF-β1 诱导的 NRK-52E 细胞凋亡。（2）激活细胞外基质（ECM）降解途径。增加 BMP-7 表达能够促进细胞外基质降解，减少多种促炎症因子，对肾纤维化具有预防和治疗作用[78-79]。MMP-2 在 ECM 的降解过程中十分重要，TGF-β1 可抑制 MMP-2 的活性及功能，而 BMP-7 可恢复 MMP-2 的表达及功能活性。（3）减少多种促炎症因子的表达。还有学者发现，在炎症反应及免疫应答过程中 BMP-7 发挥重要作用，其在心、肾等各种脏器中的作用已有明确报道[80]。Li 研究结果表明 BMP-7 通过抑制氧化应激和包括 p38 和 p44/42 MAPK 在内的多种炎症信号通路来抑制糖尿病肾病中的管状促炎反应[81]。研究证明 BMP-7 通过上调张力蛋白同系物（PTEN）特异性抑制肾集合管和肾小管上皮细胞中 TGF-β1 表达[82]。
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四、文献综述......................6
五、材料与方法......................6
结果
一、肾组织形态学改变
1、肾脏大体观察
本实验大鼠单侧输尿管结扎后，随着梗阻时间延长，与 Sham 组左侧肾脏相比，UUO 组左侧肾脏体积明显增大、外观饱满、膨出，呈苍白色。纵行切开肾脏可见流出黄色清亮尿液，剖面可见皮髓质因梗阻受压变形、变薄，肾盂肾盏明显扩张，肾乳头缺血萎缩。与 UUO 组术后同天相比，GBE 组左侧肾脏保留的肾皮质略多。
2、光镜下肾脏病理变化
（1）HE 染色：术后第 3 天时，UUO 组部分肾小管出现扩张增大，肾小管上皮细胞轻度肿胀；第 7 天时，肾小管明显扩张，肾小管上皮细胞肿胀较前加重，出现空泡征和炎性细胞浸润；第 14 天时，上述改变更加明显，部分肾小管变形、扭曲、萎缩，可见管型，TIS 逐渐增高，差别有统计学意义（cP <0.05、 dP <0.05）；Sham 组无上述改变，与 Sham 组对应的时间点相比较，UUO 组的各时间点 TIS 增高，差别有统计学意义（ aP <0.05）；与 UUO 组对应的时间点相比较，GBE 组肾小管形态损伤减轻，TIS降低，差别有统计学意义（ bP <0.05）；见表 1、图 1、附图 1。
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一、肾组织形态学改变
1、肾脏大体观察
本实验大鼠单侧输尿管结扎后，随着梗阻时间延长，与 Sham 组左侧肾脏相比，UUO 组左侧肾脏体积明显增大、外观饱满、膨出，呈苍白色。纵行切开肾脏可见流出黄色清亮尿液，剖面可见皮髓质因梗阻受压变形、变薄，肾盂肾盏明显扩张，肾乳头缺血萎缩。与 UUO 组术后同天相比，GBE 组左侧肾脏保留的肾皮质略多。
2、光镜下肾脏病理变化
（1）HE 染色：术后第 3 天时，UUO 组部分肾小管出现扩张增大，肾小管上皮细胞轻度肿胀；第 7 天时，肾小管明显扩张，肾小管上皮细胞肿胀较前加重，出现空泡征和炎性细胞浸润；第 14 天时，上述改变更加明显，部分肾小管变形、扭曲、萎缩，可见管型，TIS 逐渐增高，差别有统计学意义（cP <0.05、 dP <0.05）；Sham 组无上述改变，与 Sham 组对应的时间点相比较，UUO 组的各时间点 TIS 增高，差别有统计学意义（ aP <0.05）；与 UUO 组对应的时间点相比较，GBE 组肾小管形态损伤减轻，TIS降低，差别有统计学意义（ bP <0.05）；见表 1、图 1、附图 1。
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慢性肾病（CKD）是一个越来越严重的公共健康问题，肾脏排泄功能由于肾组织损伤、功能障碍和肾单位丢失而逐渐和不可逆转地下降。由于缺乏特殊的治疗措施来保护肾功能，患有 CKD 的患者面临着沉重的经济负担和不良预后。CKD 逐渐发展为终末期肾功能衰竭，最终引起肾间质纤维化。抑制肾纤维化进展是肾保护关键策略。目前研究显示银杏叶提取物对肾纤维化中 TGF-β1 表达具有抑制作用，但对 BMP-7 表达影响尚未见报道，因此本实验研究银杏叶提取物对肾间质纤维化中 TGF-β1、BMP-7 表达影响，探讨银杏叶提取物肾脏保护作用的机制。
尿路梗阻是引起急性肾损伤和慢性肾脏病的诸多原因之一。尿路梗阻性疾病发生率最高的是儿童，通常是胚胎发育期间出现的先天性缺陷导致尿道的解剖异常。UUO 模型是最广泛使用的肾损伤和尿路梗阻实验模型之一。在大鼠单侧输尿管梗阻模型中，巨噬细胞等炎性细胞诱导的细胞外基质生成以及肌成纤维细胞迁移逐渐引起肾小管间质纤维化，可观察到肾皮质中进展性肾小管间质纤维化。研究表明，在新生大鼠阻塞 48 小时后缓解，不能恢复肾单位损失的 40％，并且不能改善肾小管增生。UUO 大鼠模型制作相对简单，操作方便，成功率较高，而且对肾小球的影响不大，它不涉及使用外源性毒素，也不会产生尿毒症环境，肾纤维化典型，与人肾纤维化的病理改变具有可比性，
因此本实验选用 UUO 动物模型，研究银杏叶提取物发挥肾脏保护作用的机制。
参考文献（略）
参考文献（略）