前 言
钛种植体是目前应用于口腔牙齿缺失较为理想的修复材料，具有良好的生物相容性和骨结合特性，然而仍存在由于骨结合不良造成的失败案例。因此，对于种植体表面的修饰处理一直以来都是种植体领域的研究热点。近些年来，利用生物分子进行种植体表面活化成为研究的一个重要方向，其中利用 RNAi 技术对种植体表面活化具有作用靶向、稳定、持久等优点，是生物活化中的研究热点。随着 RNAi 功能化支架在组织工程中应用的广泛研究，对钛种植体表面修饰也提供了重要的参考意义。与此同时，在另一个方向上，种植体的表面物理形貌优化也是种植体表面修饰的传统方法，但对形貌诱导细胞行为的分子机制研究尚不深入。虽然我们课题组在前期进行了大量的关于微米坑结构和纳米管结构对成骨分化影响的相关研究，并对相关的分子信号通路进行了初步阐释，然而尚有诸多问题有待于进一步探索。因此，本研究首先利用 RNAi 技术的优越性，对钛种植体表面进行生物活化，通过各种手段对材料表面进行表征，明确涂层加载的特点，并通过生物学验证，明确活化后的种植体表面的生物学性能。其次，对种植体表面形貌和细胞反应进行了深入研究，主要是通过亚细胞结构变化和细胞自噬角度进行阐释。本研究旨在寻找更为合理优越的种植体表面生物活化方法，进而提高种植体骨结合；另一方面，为了更好的阐释生物材料表面微观结构对细胞行为影响的本质，从而为指导生物材料的表面结构设计提供理论支持。
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文献回顾
一．钛种植体表面生物修饰
1 钛种植体表面处理概述
纯钛具有较强的机械强度以及优良的生物相容性和骨诱导特性，很早以前就被Br nemark 等人发现可以与骨组织形成牢固的骨结合[1]，直至目前仍是最为理想的骨植入材料。种植体骨结合的生物学基础是种植体周围成骨相关细胞，包括骨髓间充质干细胞、成骨前体细胞和成骨细胞，在种植体表面的募集、增殖和成骨分化的过程[2]。由于细胞对于钛种植体表面不同的处理方式具有不同的生物学响应，因此为了进一步高效快速的促进钛种植体表面骨形成，对局部种植体表面进行处理是最常选择的方式[3]。钛种植体表面处理技术十分庞杂，使用的技术方法林林总总，概括起来目前主流的种植体表面处理技术可以分为物理形貌设计、化学元素掺入和生物分子的加载等。三种方法各有特色，其中物理结构的设计是最早进行的研究，其疗效较为明确，已经广泛的应用于临床治疗，临床上使用的 ITI 种植系统使用的是喷砂酸蚀处理形成的粗糙表面，Nobel 系统使用的是微弧氧化形成的微米孔洞表面；化学元素掺杂和生物分子的加载效果较为明确，通常与优化的物理形貌联合应用，在一定形貌基础上进行元素掺入或涂层制备，目前大多处于实验室研究阶段。种植体表面处理技术的基本依据是成骨分化在处理后表面的增强效应，因此其研究手段包括材料表面设计、涂层制备表征、成骨效应和机理分析等步骤。现依据文献，逐一分析。
1.1 物理形貌设计
对种植体表面形貌结构的设计研究非常经典也最为成功，早在种植体研究的早期人们就已经发现粗糙的表面有利于细胞的成骨分化[4]。目前已经应用于临床的种植体表面结构包括喷砂酸蚀和微弧氧化形成的微米坑结构和微米孔洞结构。喷砂酸蚀能够在种植体表面形成均一稳定的微米坑和亲水性表面，有利于细胞的定植和分化[5]。微弧氧化利用高电压下的弧光放电，使得钛种植体表面形成微米级的孔洞结构，同时电解液在表面发生化学变化，形成一层羟基磷灰石涂层，具有骨诱导特性，体内成骨效果较为优良[6]。在实验室中，物理形貌的设计则多种多样，无统一定论。按照尺度，可以分为微米级形貌、纳米级形貌和微纳米混合形貌，而微观结构又存在点阵、沟、线、管状、柱状、片层等多种形态。例如我们课题组前期大量的研究集中于采用阳极氧化的方法制备垂直于基底的二氧化钛纳米管阵列，就是一种纳米级管状结构[7]；利用水热反应，可以形成垂直于基底的二氧化钛纳米柱结构[8]；使用激光喷丸技术可以在钛表面形成规则的沟状形态[9]；碱热反应可以在钛表面腐蚀出线样结构[10]；近些年来，利用石墨烯制备出片层结构也处于研究热门[11]。总之，物理形貌设计虽然受限于技术条件，然而能够形成的表面结构也层出不穷，细胞对它们的反应也不尽相同。关于物理形貌影响细胞行为的机制将在后文详细阐述。
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1.2 化学元素掺入
对钛种植体表面掺入不同的活性元素是另一种广泛采用的表面处理方法。许多化学元素具有特殊的生物学效应，在合适的浓度下具有良好的潜在应用价值。例如 Sr、Zn、Mg 等均可以显著促进 BMSC 的成骨分化[12-14]，而 Co则能促进其成血管分化[15, 16]，因此掺入这些金属元素在种植体表面的研究十分广泛，效果显著。事实上关于 Sr、Co等元素的功效机理的研究被广泛展开，多条信号通路均参与其中。Peng S 等研究证实Sr 促进 BMSC 成骨分化通过 Ras/MAPK 通路[17]，具体而言，Sr 处理的细胞 ERK1/2和 p38 磷酸化增强，而 ERK1/2 和 p38 的抑制剂则抵抗了 Sr 对成骨分化的促进作用；进一步研究发现 ERK1/2 和 p38 上游的 RAS 表达上调，抑制 RAS 表达后 Sr 的成骨效应消失。另一方面，FAN YANG 等的研究则表明 Wnt/β-catenin 可能是其中的关键通路[18]。Co 对血管生成的促进作用一般认为和 HIF-1α 有关[19]，通过激活 HIF-1α 从而提高VEGF 的表达，促进血管生成[20]。不仅金属元素具有很强的成骨活性，许多非金属元素也具有良好的促进成骨分化的作用。很早以前人们就已经发现 F 与骨代谢密切相关，并使用 F 治疗骨代谢疾病[21, 22]。在适当浓度范围内，F 能够促进牙周膜干细胞的增殖和矿化[23]，因此将 F 掺入钛种植体表面可以显著促进成骨细胞分化和种植体周围骨形成[24, 25]。关于 F 作用机制研究目前尚不明确，K.-H. William Lau 等总结出了两种可能性，均与 MAPK 通路相关[26]，其一是 F 抑制氟敏感性磷酸络氨酸磷酸酶，从而使得MAPK 上游的关键激活分子持续高表达；其二是通过与 Al 形成复合物，激活 Gi/o 蛋白和蛋白络氨酸激酶，从而激活 MAPK。另一个广泛研究的非金属元素是 N 元素，Wei Zhang 等采用等离子技术将 N 注入植入体表面，能够显著促进 BMSC 成骨分化[27]，进一步的研究表明，这种促进成骨的作用可能是表面电荷引起，通过 iNOS 信号通路发挥成骨效应[28]。此外，还有采用离子注入技术将 C 元素掺入钛种植体表面，对成骨分化和体内骨形成均具有良好的促进作用[29]。在化学元素的掺入研究中，一种元素常常具有多重功效，而为了获得多重功效也常常将不同元素同时掺入。例如在掺 Sr 种植体促进成骨分化的过程中也同时促进了血管生成[12]，而掺 Co 元素的种植体则也同时具备成骨和成血管双重功效[15]。更为直接的获得多重功效的方法是多种元素同时掺入，例如将 Co、F 同时掺入获得成骨成血管双重功效[30]；甚至有将 Sr、Co 和 F 三种元素同时掺入，获得抗菌、成血管和成骨三重功效[31]。
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实验三 阴极电沉积构建 RNAi 功能化钛种植体表面.............. 57
引言.... 57
1 材料与仪器 .......... 57
2 方法 ........... 58
3 结果 ........... 60
4 讨论 ........... 66
5 结论 ........... 67
实验四 自噬对 siRNA 转运的影响研究 .............. 68
引言.... 68
1 材料与仪器 .......... 68
2 方法 ........... 69
3 结果 ........... 70
4 讨论 ........... 76
5 结论 ........... 77
4 讨论
细胞自噬是一个热点内容，由于其重要的生理和病理作用，参与了多种细胞学过程和疾病调控，获得了2016年的诺贝尔奖。考虑到自噬在成骨分化中扮演的重要角色以及和细胞膜、细胞骨架等密切关系，我们推测材料表面不同的物理形貌势必会对自噬过程造成影响。自噬发生时，细胞内特征性的出现许多囊泡状结构，统称为自噬泡，MDC能够特异性的集聚在自噬泡中，因此可以通过荧光强度对自噬活性进行简单快速的检测；而透射电镜下直接找到特征性的自噬泡结构则能够提供更直接的证据；自噬小体表面聚集LC3II，在自噬潮中被降解，因此通过western blot检测LC3II的动态变化能够获得自噬泡的动态变化信息，而加入溶酶体抑制剂氯化铵后抑制自噬潮，出现LC3II降解不良。在本实验中我们首先发现了纳米管形貌表面能够诱发细胞mTOR-independent自噬反应，这初步证实了我们的推测。经典的饥饿诱发的自噬反应属于mTOR-dependent类型，通过抑制mTOR并与蛋白磷酸酶2A联合激活自噬过程[251]，在本实验中细胞在不同形貌表面的营养状况类似，因此mTOR的活性未受到显著抑制。形貌激活的自噬存在自身的特点，即暂时性和可逆性，这可能是和细胞应激反应的适应性有关[252, 253]。事实上自噬反应是细胞对外界刺激发生的一种保护性反应，可以想象细胞在和材料早期接触的时候收到来自于材料形貌的刺激，由于纳米管形貌的刺激可能比较温和，因此随着孵育时间的延长，细胞适应了基底材料的形貌特征，从而自噬活性回到常规水平；这也可以解释当细胞在不同形貌表面稳定后再次接触不同形貌仍会发生同样的自噬变化，可能是由于细胞重新接触了不同的刺激，在短期内自噬活性的差别能够体现出来。另一方面，长期的过度自噬反应会诱发细胞凋亡[254]，在纳米管形貌表面细胞长期的活力未收到显著影响，从侧面也证实了形貌诱发的自噬具有暂时性，可以通过细胞自身的适应能力而回归正常水平。
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小 结
本课题分成两大部分，第一部分对钛种植体表面 RNAi 功能化修饰进行了系统的研究，第二部分对钛种植体表面形貌信号转导进行了部分探索。目前关于钛种植体表面生物修饰的研究代表了新一代种植体表面活化的研究方向，尤其是 RNAi 技术在骨组织工程中的广泛研究，为其在种植体表面修饰奠定了理论基础和实践经验；钛种植体表面形貌信号转导一直以来困扰着材料和细胞行为机理的研究，在课题组前期研究中发现了许多关键的经典分子信号通路参与其中，而对于亚细胞结构的功能变化尚不明确。经过一系列实验探索，本研究得出的结论如下：
(1) 通过简单吸附的方法可以在微弧氧化的钛种植体表面制备壳聚糖/miRNA 涂层；涂层分布均匀一致、释放缓慢；在大鼠原代 BMSC 中转染高效，细胞相容性良好；应用 miR-148b 后 BMSC 成骨分化得到显著增强。该实验证实钛种植体表面RNAi 功能化具有可行性。
(2) 采用 LbL 分子自组装技术可以在光滑钛表面制备由壳聚糖/siRNA 和透明质酸组织的多层结构涂层；水接触角和表面粗糙度呈现波动变化，提示多层结构的形成；SEM 观察能够更为直观的观察壳聚糖与透明质酸的嵌合结构；随着层数的增加，siRNA 加载量逐渐增加，提示可以通过层数的控制来调控 siRNA 加载量；修饰后的涂层在 H1299 细胞中可以实现靶基因的持续沉默，细胞活力未受到显著影响；在应用 siCkip-1 后能够使 MG63 细胞的成骨分化得到显著提升。
(3) 使用阴极电沉积的方法可以高效的在数分钟内在 NTs 表面制备壳聚糖/siRNA 涂层；随着电流密度的增加，纳米管口逐渐被壳聚糖复合物覆盖，呈现多孔状结构；电流密度与加载电压成正比，随着加载时间延长而下降；种植体表面 siRNA的加载量与电流密度和加载时间成正比，提示可以通过控制加载电压和时间进行 siRNA 加载量的控制；在不同 pH 环境中阴极电沉积形成的涂层 siRNA 释放模式不同，提示可以通过控制环境不同 pH 实现 siRNA 释放的控制；在原代大鼠 BMSC 中能够实现靶基因的持续沉默，对细胞粘附和活力无显著影响；应用siCkip-1 后细胞成骨分化得到显著增强。
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参考文献（略）