第一章 绪论
1.1 微生物胞外多糖
微生物产生的多糖由于其新颖和独特的理化性质，正吸引着越来越多的关注。微生物产生的大量胞外黏液可以很容易从发酵液中分离，因而具有非常巨大的商业化潜力。近些年来，微生物胞外多糖因其生产周期短、不受地理环境气候影响以及对环境的友好性，在许多的领域有着广泛的应用。微生物多糖已迅速成为食品材料中非常重要的新型工业化资源，并且变得越来越有竞争力。在食品行业，微生物多糖通常作为乳化剂、稳定剂、粘结剂、胶凝剂、混凝剂、润滑剂、成膜剂、增稠剂和悬浮剂等。
微生物胞外多糖可分类为同聚多糖和杂多糖。同聚多糖一般为中性的葡聚糖，而大部分杂多糖因其糖醛酸的存在含有阴离子。一些已经商业化生产的微生物胞外多糖如表1-1 所示。在这些微生物胞外多糖中，普鲁兰多糖是由类酵母菌出芽短梗霉合成的真菌胞外多糖，作为一种新兴的商业化生物聚合物正受到越来越多的关注。
1.2 普鲁兰多糖的历史概述
到目前为止，只有极少数的真菌胞外α葡聚糖被报道。普鲁兰多糖是最适合研究的α型连接的葡聚糖。1938年，Bauer观察到出芽短梗霉能够产生这种胞外黏性多糖。1958年，Bernier 首次从出芽短梗霉的发酵液中纯化并分析了多糖。1959 年，Bender 等人研究了这种新多糖，揭示了这种胞外多糖的所含的碳和氢原子与化学式 C6H10O5相同，这种聚合物可以与二价铜离子形成复合物，但与淀粉不同的是，与碘不产生颜色反应，红外光谱数据显示，这种多糖含有α-（1-4）和α-（1-6）键，并将其命名为Pullulan。
在此之后，许多研究小组报道了普鲁兰多糖的结构并不仅仅只包含α-（1-4）和α-（1-6）键，还存在少量的α-（1-3）键。Wallenfels 等人发现通过普鲁兰酶可以专一性的水解普鲁兰多糖的α-（1-6）键形成由α-（1-4）键连接的麦芽三糖重复单体[6,7]。Gibbs、Leathers 和Shingel 等人也对普鲁兰多糖的结构分别进行了阐述。
从1976年到1980年，许多学者研究了出芽短梗霉的发酵技术和普鲁兰多糖的性质，为第一个研究高峰。从1984年到1996年，大量对普鲁兰多糖的产生机理以及应用的报道存出不穷，为第二个研究高峰。发酵方面研究主要集中在优化培养条件，保持细胞高生产力，缩短发酵时间，降低生产成本，提高最终产品纯度以满足食品、化妆品和医药的需求。
在日本，普鲁兰多糖很早就就被批准作为食品添加剂和制药填充剂。在美国也获得FDA 权威认证。目前普鲁兰多糖作为低能量食品添加剂和极好的成膜性能被广泛报道。日本冈山的林原公司从 1976 年开始商业化生产普鲁兰多糖，并一直处于垄断地位[11]。林原公司通过调整培养基的条件来生产特定化分子量和规范的普鲁兰多糖，食品级（PF）和去离子级（PI）的产品，平均分子量为100，000（PI-10 和PF-10）和200，000（PI-20和PF-20）。普鲁兰多糖膜也是由林原公司在 1982年商业化的。林原生化实验室授权美国辉瑞制药公司商品化并出售含有该实验室专利性普鲁兰多糖的膜型口腔护理用品，并为辉瑞制药公司的子公司华纳-兰伯特公司提供普鲁兰多糖粉末。尽管普鲁兰多糖已经商业化生产 30多年，但目前售价高达 25美元/kg，所以有着极高的商业利润和市场前景。
第二章 普鲁兰多糖生物合成糖代谢途径探讨
2.1 前言
微生物细胞含碳量约占干重的一半，碳源是除水外需要量最大的营养物，又称大量营养物。对于微生物来说，一般单糖优于双糖和多糖，己糖优于戊糖，葡萄糖、果糖优于甘露糖、半乳糖；在多糖中，淀粉明显优于纤维素或几丁质等纯多糖，纯多糖则优于琼脂等杂多糖。对于出芽短梗霉，大量文献报道蔗糖作为碳源底物时产量最高，蔗糖被证实由于其高转化率，是出芽短梗霉合成普鲁兰多糖最优的碳源。目前的研究理论认为是由于蔗糖在被出芽短梗霉利用时会先被降解为果糖和葡萄糖，这一降解作用会激活普鲁兰多糖的合成酶系，而且在果糖异构化作用的刺激作用下，促进了普鲁兰多糖的合成。但蔗糖作为二糖由葡萄糖和蔗糖构成，转化为普鲁兰多糖需要经历比葡萄糖、果糖更多的代谢步骤，因而我们对出芽短梗霉如何利用蔗糖进行了更深入的研究。
生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解（glycolysis），主要有 EMP途径、HMP途径、ED途径。中心代谢途径是所有生物细胞生命活动的基础，它将从外界获得的营养物质转变为自身需要的结构单元，为细胞的生理活动和产物合成提供结构单元和前体物质，ATP 形式的吉布斯自由能，形成 NADH 和 NADPH 形式的还原力等。目前关于出芽短梗霉的中心代谢途径仍不明确，所以验证这些途径存在与否对于探讨出芽短梗霉代谢调控机制是非常必要的。
2.2 材料与仪器
2.2.1 实验材料与试剂
出芽短梗霉（A. pullulans）CGMCC1234，Pseudomonas sp.No.2120和SphingomonaspaucimobilisATCC31461为本实验室选育保藏。
酵母粉购自Oxoid公司；蔗糖，麦芽糖，葡萄糖，果糖，甘露糖，半乳糖，木糖，水溶性淀粉，牛肉膏，玉米浆粉，蛋白胨，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，硫酸铵，硫酸镁，七水合硫酸镁，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，乙醇，三羟甲基氨基甲烷，氯化镁，氯化钾，醋酸钠，二硝基水杨酸，乙腈，乙二胺四乙酸二钠，甘氨酸购自国药集团化学试剂有限公司；EDTA二钠 NADP，6-磷酸葡萄糖，2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸，L-乳酸脱氢酶，ATP，二磷酸果糖醛缩酶，磷酸甘油脱氢酶，磷酸果糖激酶购自sigma公司。
2.2.2 实验仪器
PG6002-S型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FA1004电子天平：上海天平仪器厂；SW-CJ-1F型超净工作台：苏净集团泰安公司；HYG-IIa回转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；GH-400BC隔水式恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器厂；LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器：上海华线医用核子仪器有限公司；UV2100型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；KF-5L发酵罐：韩国高百特生物工程公司；自动进样高效液相色谱仪：日本日立公司；真空冷冻干燥机：美国LABCONCO公司；DY89-I电动玻璃匀浆机：宁波新芝生物科技股份有限公司。
第三章氮源对出芽短梗霉代谢调控的蛋白质组分析.........26
3.1前言.......26
3.2材料与仪器.........26
3.2.1实验材料与试剂.......26
3.2.2实验仪器.........26
第四章吐温80调控普鲁兰多糖合成的机理研究.........36
4.1前言.......36
4.2材料与仪器........36
第五章基于出芽短梗霉细胞生理代谢的发酵调控.........47
5.1前言.....47
5.2材料与仪器.......47
第六章 控制温度和pH的两阶段优化普鲁兰多糖发酵
6.1 前言
发酵时的温度和环境pH 对微生物生长、产物和复产物的代谢影响很大。温度升高时，细胞内的化学和酶反应也会加快，但同时一些对高温比较敏感的蛋白质、核酸和其它细胞成分有可能产生可逆的失活。同一温度对微生物生长和发酵的影响不同，而同一微生物的最适生长温度和不同产物的最适温度都会不同。每种微生物细胞的生长繁殖均有其最适 pH，细胞及酶的生物催化反应也有相应的最佳 pH范围。在培养基制备及产物提取、纯化过程中，也需要控制适当的 pH。因此发酵对pH的要求极为严格。
本章研究了不同温度和 pH下的出芽短梗霉发酵产普鲁兰多糖的情况，然后根据结果提出两阶段控制温度和 pH的培养模式，第一阶段快速提高生物量，第二阶段促进普鲁兰多糖的合成，进行发酵优化。
主要结论与展望
主要结论
1、各种碳源中，蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖作为底物时，普鲁兰多糖的产量较高，其中蔗糖为底物时产量最高。麦芽糖、木糖、可溶性淀粉和半乳糖作为碳源底物时，普鲁兰多糖产量明显较低。发酵液中蔗糖并不是简单的分解成果糖和葡萄糖，而是由出芽短梗霉分泌β-呋喃果糖苷酶生成蔗果三糖，从而降低了发酵液环境对细胞的渗透压，而后蔗果三糖再次被分解作为碳源利用。出芽短梗霉产生的β-呋喃果糖苷酶是一种诱导性酶，受到碳源的影响。培养基中存在蔗糖时，产量最高，麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、作为底物时酶活都较蔗糖低，木糖和可溶性淀粉作为碳源时，没有酶活。
2、出芽短梗霉细胞破碎液中并没有检测到 ED途径中关键酶 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的酶活，而具有 EMP 途径和 HMP 途径的关键酶磷酸果糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，因而出芽短梗霉中心代谢途径由EMP 途径、HMP 途径、TCA循环构成，并不存在ED 途径。碘乙酸会抑制EMP 途径导致HMP 途径通量的增加，造成普鲁兰多糖产量的降低。低浓度的碘乙酸会促进菌体的生长，但高浓度的碘乙酸会抑制菌体生长。
3、过多的氮源使碳通量流向生产生物量，氮源的消耗意味着出芽短梗霉发酵产生更多胞外多糖。低氮浓度（0.6g/L的硫酸铵）更适宜普鲁兰多糖的合成。首次建立出芽短梗霉的二维图谱，选取培养基初始硫酸铵浓度为0.6g/L 和1.2 g/L 生长到60小时的细胞，提取其全细胞蛋白用于蛋白质组的分析。通过ImageMaster软件分析，大约有1100个可视化的蛋白点。
4、在MALDI-TOF/TOF分析的的19个差异值最大的蛋白点，与真菌物种和其它微生物的已知蛋白进行匹配，共有12个蛋白被成功鉴定，达到63%的鉴定率。12个成功鉴定的蛋白中，氮源限制的样品有7个下调和5个上调。下调的鉴定蛋白包括初生关联多肽复合体β亚组、过氧化物氧化还原酶-6、α-葡聚糖分支酶、二磷酸果糖醛缩酶、精氨酸酶、烯醇酶、假设蛋白ARB_01037。相较之下，上调的鉴定蛋白包括氰酸酯水合酶、线粒体过氧化物氧化还原酶-1、假设蛋白SMAC_07435、ATP合酶β亚组、热休克蛋白70。这些蛋白涉及到能量代谢，抗氧化，氨基酸合成代谢，糖原合成，糖酵解，蛋白运输和转录调控。
参考文献（略）