1 绪论
1.1灵芝及灵芝子实体简介
灵芝从我国古代很早开始就有记载，《山海经·中山经》里就有炎帝之女瑶姬不幸夭折化为瑶草的故事，而此中的瑶草即为我们所说的灵芝。灵芝子实体是灵芝的繁殖器官，而古今中外所说的灵芝一般都是指灵芝的子实体。
灵芝属于异养型的生物。它的细胞内没有叶绿素，不能通过光合作用合成碳水化合物。因此，它必须营腐生或寄生生活，从现成的有机化合物中获得碳和氮作为养料。灵芝的子实体只有在特定的营养和环境条件下才出现和发生，由菌盖（芝盖）和菌柄（芝柄）组成。野生灵芝的产量较低且较难获得，灵芝子实体的人工栽培使得灵芝子实体的大量生产成为可能，目前主要的灵芝子实体栽培方式有代料栽培及椴木栽培。然而这些人工栽培的灵芝子实体质量良莠不齐，其实际功效并不稳定一致，科学而有效的灵芝类产品质量检测方法和控制标准的建立已成为当今功能食品和药品的产业发展中急需解决的重要课题。
灵芝之所以千百年来一直受到人们的广泛关注主要是因为灵芝的生理活性。国内外的研究表明，灵芝的药理活性归因于其中含有的多糖、三萜、腺苷、生物碱、甾醇和有机锗等，而灵芝多糖是其主要功能成分之一，在灵芝的药用保健功能中发挥着极其重要的作用。而其活性与多糖的组成和结构密切相关。
1.2 灵芝多糖的研究进展
1.2.1 灵芝多糖提取方法
灵芝多糖的具体提取方法各不相同，但都是依照灵芝多糖易溶于水或稀酸、稀碱溶液而不溶于丙酮、醇等有机溶剂的特点进行提取[6]。基于灵芝多糖广泛的药用价值，大量学者开始进行对灵芝多糖的研究，如何有效的提取灵芝多糖对后续的研究极其重要，灵芝多糖的提取则为研究成功与否的第一步。灵芝子实体成熟变干后为木栓质，硬度较大，而灵芝子实体多糖存在于子实体紧密的胞壁中，从而导致提取时间较长、而提取率也相对较低。目前为止，灵芝多糖的提取方法主要有水浴回流提取、超声辅助提取、酶法提取、微波辅助提取、超声-微波辅助协同萃取、加速溶剂萃取、超临界提取法等。
1.2.2 灵芝多糖的分离纯化方法
经提取所得到的灵芝多糖需进一步的纯化，主要是因为在提取过程中会同时将色素、蛋白质等物质提取出来，另一方面灵芝多糖往往会与蛋白质等结合，而且灵芝多糖通常是由多个组分组成，因此想要得到纯度较高的灵芝多糖组分，还需进一步分离纯化。
1.2.2.1 灵芝多糖的脱蛋白方法
Sevag 法：Sevag 法除蛋白质来源于 1938 年 Sevag 等为使从链球菌中提取的核蛋白的蛋白质部分和核糖部分分离而采用的利用氯仿和抑制泡沫生成试剂的混合液去除蛋白质的方法。它的主要原理是氯仿使蛋白质变性形成氯仿-蛋白质复合物，根据氯仿-蛋白质复合物的密度和溶液中其他成分不同，通过静置分层以使蛋白质分离除去。这种方法只脱除了样品中的游离蛋白，条件温和，可避免多糖降解。它的缺点是处理效率不高，且容易在样品中掺入有机试剂，需要进一步除去。
酶法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶等均可高效专一的水解多糖溶液中的蛋白质，蛋白质被水解成氨基酸或者多肽链后，这些新产生的物质分子量相对较小，可以通过透析、凝胶过滤以及超滤等方法除去。陈功明等[17]研究了灵芝胞内多糖的脱蛋白工艺，在所选用的胰蛋白酶、胃蛋白酶及木瓜蛋白酶中，通过实验发现木瓜蛋白酶的脱蛋白效果最好。将木瓜蛋白酶与Sevag结合使用，发现灵芝胞内多糖的最佳脱蛋白方法为：先用木瓜蛋白酶处理，再用Sevag法处理 3次，最终蛋白脱除率可达76.3%，而多糖损失率仅为17.9%。
2 材料与方法
2.1 材料与试剂
试剂：苯酚（分析纯）；浓硫酸（分析纯，国药基团化学试剂有限公司）；三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、硝酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；TFA（化学纯）；乙腈（色谱纯、美国 Tedia 提供）；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（99％，美国 Acros Organics）。
标准品及样品：葡萄糖(Glc，99%)、甘露糖(Man，99%)、半乳糖(Gal，99%)，均购于上海化学试剂公司；鼠李糖(Rha，99%)、岩藻糖(Fuc，99%)、葡萄糖醛酸(GlcUA，99%)、半乳糖醛酸(GalUA，97%)，均为美国 Sigma-Aldrich 公司产品；木糖(Xyl，98%)、氨基葡萄糖(GlcN，98%)、氨基半乳糖(GalN，99%)，均为美国 ACROS ORGANICS 公司产品；核糖(Rib，＞99.0%)、阿拉伯糖( Ara，99%)，均购于厦门星隆达生化试剂有限公司。样品：29种不同来源的灵芝子实体，见表2-1。
材料：DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换凝胶（GE Healthcare）；HPD-300、D101、NKA-9、BS-45、LSA-20、AB-8 树脂（河北沧州宝恩材料有限公司）。
2.2实验仪器
Waters 1525 高效液相色谱仪，配置 Empower 3 色谱工作站，Waters 600 二元输液泵，自动进样器，2414示差折光检测器；Aligent 1200液相色谱系统。Beckman J-26xp 高速冷冻离心机（Beckman Coulter Inc，USA）；SCIENTZ-10N冷冻干燥机（宁波新芝生物股份有限公司）；DHG-9053A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海沪西分析仪器厂）；DAHZ-300 多用途水浴恒温振荡器；SHK-IIIS 循环水多用真空泵（郑州科泰实验设备有限公司）；RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）；HH-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）；QT-1 旋窝混匀器（上海琪特分析仪器有限公司）；BSZ-100自动收集器及玻璃层析柱（2.6 cm×30 cm、2 cm×100 cm）：均为上海沪西分析仪器厂有限公司。傅立叶变换红外光谱仪（美国 Thermo 公司提供）；多角度激光光散射仪（美国 Wyatt）；恒流泵：HL-2D 定时数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂）。
3 结果与讨论 ...............15
3.1 灵芝子实体多糖分离纯化 .................15
3.1.1 江西灵芝子实体多糖 DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析 .............15
3.1.2 浙江龙泉灵芝子实体多糖 DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析 ..........15
3.1.3 灵芝子实体多糖级分的化学组成分析 .......................16
主要结论及展望 ................33
主要结论 ...............33
展望 ...............34
3 结果与讨论
3.1 灵芝子实体多糖分离纯化
3.1.1 江西灵芝子实体多糖 DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析
将江西灵芝子实体多糖过 DEAE Sepharose Fast Flow，按 2.3.1 的方法进行洗脱，流速设为8 mL/min，每1 min接收 1管，得到的洗脱液每5管取1 mL，用苯酚硫酸法测定490 nm的吸光值，最后以管数为横坐标，吸光值为纵坐标绘制的洗脱曲线如图 3-1所示。从图中可以看出江西灵芝子实体多糖由离子交换柱层析分离得到两个级分，获得的级分用截留分子量为 3×105 Da 的透析袋蒸馏水中透析 48 个小时去除分子量 3×105 Da 以下的组分以及盐离子，减压旋蒸浓缩后冻干备用。经过以上处理得到的级分命名为GLPJD1及 GLPJD2。
主要结论及展望
主要结论
1 通过阴离子交换柱层析 DEAE Sepharose Fast Flow 对来自两个不同地区的灵芝子实体多糖进行分离纯化，并得到5种不同的灵芝子实体多糖级分。体积排阻色谱分析结果以及粗多糖纯度检测结果显示，5种灵芝多糖级分及29种灵芝粗多糖样品的纯度均较高，都可达到百分之八十五以上。
2 本实验首先进行灵芝多糖的 HPSEC 柱系统的选择，以 0.1 M NaNO3为流动相比较了Shodex OHpak SB-803、 SB-804、 SB-805 HQ 8.0 mmID×300 mmL 三根柱串联；Ultrahydrogel 250、Ultrahydrogel 2000 两根柱串联；Ultrahydrogel Linear 7.8×300mm column 两根柱串联这三个柱系统的分离效果。结果表明，Shodex OHpak SB 三根柱串联的分离效果较好，且0.1 N NaNO3、0.1 N NaAc两种流动相对其分离结果影响差异不大，故本文对粗多糖及其纯化级分的分子量分布分析和纯度检验均采用0.1 N NaNO3柱系统Shodex OHpak SB-803、 SB-804、 SB-805 HQ 8.0 mmID×300 mmL 三根柱串联系统进行分离。
3 完成了对灵芝多糖的初步组成及结构分析。首先分析了灵芝多糖级分的相对分子量分布，结果表明 GLPJD1、GLPJD2、GLPLD1、GLPLD2、GLPLD3 的相对重均分子量为4.41×106 Da、4.70×106 Da、7.86×103 Da、7.38×103 Da，1.77×104 Da。由 SEC-LLS分析结果则发现5种灵芝多糖级分的绝对分子量分别为：12.18×106、7.086×106、0.012×106、0.017×106、0.019×106 Da。5 种级分纯度均较高，是后续检验分析结果准确的必要条件。红外光谱分析则发现5种灵芝多糖级分异头碳均为β构型，这与已有关于灵芝多糖级分的分析结果基本一致，且从 1750 cm-1左右的小吸收峰发现灵芝多糖可能含有糖醛酸，而单糖组成分析验证了这一猜测。从单糖组成分析可以看出5种灵芝多糖的单糖组成相差较大，因此可能会对它们的活性产生不同的影响。
4 将采集到的 29 种灵芝子实体及分离纯化得到的灵芝多糖进行体外促进正常小鼠巨噬细胞增殖实验，检测结果发现不同来源、不同栽培方式的灵芝子实体多糖级分的活性大不相同。
参考文献（略）