第1章前言
1.1遗传多样性概述
遗传多样性是生物多样性的基础和核心，遗传变异程度的高低、变异的分布格局及种群动态的变化，这些是组成群体遗传结构的核心。遗传多样性的本质是控制物种形状的遗传物质（DNA或RNA)的结构和组成发生了改变，从而导致表现出的性状有所差异。遗传多样性在各个层次和水平上都有表现，在宏观上，表现为人体的生理代谢差异、植物的形态发育差异、动物的形态发育差异和动物行为习性差异，即表型多态；在微观上，表现为细胞结构的差异导致功能的区别、染色体结构的差异导致生物个体间的差异、蛋白质和多糖结构上的差异导致功能上的差异，即分子多态。随着生物学研究从宏观向微观的深入、研究技术不断的创新和试验方法不断的发展、改进，遗传多样性的检测也随之从传统的形态和细胞层面发展到了分子层面。遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记的特点是具有较强的多态性，便于操作且对表型性状和经济性状影响较小，因此在操作和观察上都比较方便。目前，检测遗传多样性的方法主要是从四个水平来进行检测。在表型水平，代表方法是经典的形态学标记技术；在细胞染色体水平，是细胞学标记技术；在生化水平，是同工酶标记技术；在分子水平，是分子标记技术。四个水平分析的角度和层次不同，可以互相补充验证。
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1.2分子系统地理学概述
分子系统地理学的概念首先由Avise等[6]提出，即结合分子生物学与生物地理学，以分子生物学方法重建种内和种上水平的系统发育关系，阐释其进化历史，并通过分析近缘生物类群的系统发育关系与其空间和时间分布格局之间的相关性，并以此来构建生物区系的历史[11]。其研究核心是遗传谱系空间分布的历史特征[〗2]，通过对种群遗传结构的分析来探讨种内系统地理格局的形成机制、系统发育关系以及现有分布特征，同时结合种群的地理分布状况发现、验证与其相关的地质历史事件、追溯和解释种群的进化历程。从20世纪70年代幵始，人们对线粒体DNA的认识逐渐加深，其显著的母系遗传特性、进化速率快且几乎没有重组现象发生等诸多优点为科学家们所熟知。而分子系统地理学早期的研究主要是通过mtDNA限制性酶切技术的应用来进行[14，1)],通过比较分析限制性片段长度的多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP),来探讨种群之间的系统地理模式及其系统发育关系。20世纪90年代，分子实验技术的突飞猛进，为分子系统地理学的加速发展提供了良好的条件。实验技术方面，传统的RFLP因其工作量大、信息含量低、特异性不强等缺点被操作简单、结果直观的DNA测序技术所取代[16]，且随着PCR技术的广泛应用，微量DNA的大量拷贝变的轻而易举，DNA多态性分析更加精确，使得检测遗传变异在地理分布上的格局、构建物种单倍型之间的系统发育关系、了解动物种内变异模式的进化历史等研究内容更加方便快捷[17]。
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第2章钉螺样本的采集和DNA旳提取
2.1钉螺样本果集点及时间
本实验所用的钉螺均为实验室近年来从全国各地所采集的标本，范围为10省40市73个采集点，所有采集点共计1548个样本，时间跨度为2009—2013年。具体采集点见表1。采集的钉螺反复用清水冲洗，逸峻I后鉴定是否感染血吸虫，取阴性钉螺用无水乙醇浸泡固定。2012年后采集的500个样本采用购自北京天根生物技术有限公司（Tiangen Biotech (Beijing) Co., LTD.)的海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取单个钉螺的基因组，2012年前釆集的1048个样本采用购自OMEGA公司的eZNA Mollusc DNA Kit试剂盒提取单个钉螺的基因组。所有基因组提取完毕后均放入-20°C保存备用。
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2.2钉螺基因组的提取
样本采用了两种不同的试剂盒分别提取了 10个样本，进行了提取对比实验，选择效果和价格合适的试剂盒进行大批量样本的基因组提取。
(1) OMEGA提取试剂盒试剂盒操作步骤：
① 取单只钉螺腹足肌肉组织20mg放在1.5ml离心管中，加入ML1缓冲液350ul,蛋白酶K 25 ul，于振荡器上震荡30 s，混勾后放入水浴锅中,6° C水浴30 min-2h,60° C水浴结束后，将水浴锅温度调到7° C备用。
②向离心管中加入氯仿和异戊醇比例按照24: 1混合的混合液350 ul，振荡器震荡30 s，混勻后10000 g,离心2min,将上清液移至新的1.5ml离心管中。（如果 RNA 含量较高，MA5ul25mginlRNaseA，室温下放置 10-30 min)
③将平衡收集柱放在试剂盒提供的2 ml的收集管中，加入GPS缓冲液200 ul并静置2 min,然后12000g离心2min，将废液倒入废液虹。然后向离心管中加入双蒸水700 ul，12000 g离心2 min，将废液倒入废液虹中，将平衡好的柱子放一旁备用。
④向第2步中的得到的上清液中加入等体积（不超过300ul) MBL，祸旋震荡仪上震荡15s，然后放入7° C水浴锅中，水浴l0min。
⑤向第4步水浴完的离心管中加入300ul无水乙醇，室温下祸旋震荡仪震荡15 So取混合液600ul，加入已平衡好的回收柱中，l0000g离心1 min，废液倒入废液紅中。
⑥将剩余混合液加入回收柱中，l0000g离心Imin，废液倒入废液虹中。
⑦将回收柱放入新的收集管中，并加入HB缓冲液500 ul, 10000 g离心30 s,废液倒入废液虹中。
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第3章长江下游3省湖北钉螺不同地理种群...........19
3.1材料..........19
3.2实验方法及步骤.......... 22
3.3 结果..........24
3.4 讨论..........29
第4章基于微卫星标记的湖北钉螺小尺度景观群体遗传..........31
4.1材料..........31
4.2实验方法及步骤.......... 35
4.3结果与分析.......... 38
4.4讨论.......... 43
第5章总结..........45
第4章基于微卫星标记的湖北钉螺小尺度景观群体遗传结构研究
湖北松滋地区位于湖北省西南部，地形西高东低，从西南海拔500 ~ 800米较高区的山地向海拔50米以下的江汉平原湖区呈四阶梯递降，境内河渠纵横，间有湖泊，其境内有螺环境多样，主要包括境内沟渠型和山丘型等，且不同类型环境下钉螺随生境变化呈现出不同螺壳形态，这种在小尺度生境湖北钉螺种群中呈现明显表型差异的现象并不多见。微卫星DNA标记是广泛分布于真核生物基因组中的一类简单的短核苦酸串联重复序列，具有多态性高、重复性高、呈共显性表达、易检测和符合孟德尔分离等优点，因此被广泛应用于群体遗传多样性分析。国内应用微卫星标记进行湖北钉螺遗传多样性的研究开展较晚，且仅有少量应用微卫星锚定进行群体遗传变异研究的报告本研究应用多态性微卫星DNA标记位点，分析了湖北钉螺松滋地区小尺度生境种群遗传结构，以探讨其遗传分化程度。
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总结
本研究利用两种试剂盒做了抽提实验对比、利用rDNA-ITS分子标记对长江下游3省湖北钉螺不同地理种群的群体遗传结构进行了研究，以及利用微卫星标记对松滋地区湖北钉螺进行了小尺度景观群体遗传结构研究，取得如下主要成果：
1.对比研究了天根生化科技的海洋动物基因组DNA提取试剂盒和OMEGA公司的eZNA Mollusc DNA Kit试剂盒提取单个钉螺的基因组的提取效率和性价比。OMEGA公司的eZNA Mollusc DNA Kit试剂盒提取效率高、蛋白质含量低，但是成本高，且需要用到氯仿，有一定的危害性；天根生化科技的海洋动物基因组DNA提取试剂盒虽然提取效率比OMEGA公司的试剂盒低，但是成本较低且不需要用到氯仿。因此，如果样本量少且比较珍贵，建议采用OMEGA公司的eZNAMollusc DNA Kit试剂盒；若样本量大且比较容易获得，建议采用天根生化科技的海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取。
2.利用rDNA-ITS分子标记对长江下游的江西、安徽和江苏3省9个种群的湖北钉螺不同地理种群进行群体遗传结构分析，探讨了 rDNA-ITS分子标记在钉螺扩散路径监测中应用价值。9个种群共获得序列100条，其中有效序列共有93条，93条有效序列共有78个单倍型，核甘酸多样性（P/)、平均单倍型多样性(70分别为0.01288和0.987，这表示9个采集点的钉螺种群遗传多样性高于平均水平；AMOVA分析表明变异主要来自群体内，种群间的遗传距离为0.0019?0.0023，9个种群间的遗传分化指数Fst为0.24957，显示钉螺种群间遗传分化程度较高；虽然家系网络图显示9个种群的所有单倍型形成3个主要的家系分支，但是各地理种群的不同单倍型在家系网络图中并没有出现明显分化，因此可以说明，长江下游的江西、安徽和江苏3省沿长江分布的湖北钉螺群体遗传多样性主要存在个体间，群体间未形成明显的遗传分化；同时，rDNA-ITS分子标记在钉螺扩散路径监测中应用价值也需要进一步研究。
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参考文献（略）