本文是一篇临床医学论文，本试验进一步验证了Rab7在EMCV感染中的作用。结果提示，Rab7不参与EMCV感染HeLa细胞，但会通过影响Rab5蛋白表达量间接抑制EMCV感染HeLa细胞。
第一章 文献综述
1 脑心肌炎病毒（EMCV）研究进展
脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种无包膜单链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒家族（Picornavirus），可导致哺乳动物心肌炎、脑炎、糖尿病和生殖障碍[1]。Picornavirus主要有四个分支：肠病毒（Enterovirus）、心病毒（Cardiovirus）（包括EMCV）、鼻病毒（Rhinovirus）和口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）[2]。自发现至今，EMCV在欧洲[3]、加拿大[4]、南美洲[5, 6]、中国[7]等地区都有报道，EMCV通过污染的水源、食物、患病尸体等途径传播，可感染鼠、猪、大象、羚羊、鸟类以及非人类灵长类动物，传播场所通常在养猪场、动物园等动物饲养密度较高的区域。猪感染EMCV则会导致急性心肌炎猝死或是生殖障碍[8]。啮齿类动物是该病毒的自然宿主[9-12]。
1.1 EMCV的发现和分离
1945年，Helwig和Schmidt从一只死于肺水肿和心肌炎的雄性长臂猿身上首次分离出脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)[9]。1948年，Dick等人从乌干达恩德培的一只患有后肢麻痹的普通猕猴身上分离出Mengo病毒[13]，中和试验表明，Mengo与EMCV与抗血清存在交叉反应，提示它们属于同属病毒，之后确定Mengo为另一种心病毒属成员。我国首株EMCV毒株于2005年成功分离，血清学研究发现国内猪群EMCV抗原普遍阳性[14]。Shaomin等人发现，从猪和大鼠中分离得到的EMCV毒株二者之间具有高度同源性，这表明EMCV具有跨物种传播能力[15, 16]。
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2 发动蛋白Dynamin研究进展
2.1 Dynamin结构与功能
1989年，Shetner和Vallee首次从小牛大脑中分离出Dynamin，并证实了Dynamin可以诱导微管形成六边形排列的束型结构[37]。Dynamin是鸟苷三磷酸酶(Guanosine triphosphatase,GTPase)家庭成员蛋白，多肽链约由871个氨基酸组成，分子量约为100 kDa，由GTPase结构域(1-299 AA)、中间结构域(300-511 AA)、pleckstrin同源性结构域(Pleckstrin homology domain,PH,511-622 AA)、GTPase效应器结构域(GTPase effector domain,GED,623-750 AA)和C末端的富含脯氨酸结构域(Prolone-rich domain,PRD,751-871 AA)组成[38, 39]（图1.2）。GTPase结构域是Dynamin中高度保守区域，与GTP的结合与水解相关[40]，中间结构域参与Dynamin环状四聚体的自组装[41]，PH结构域具有较低的脂质特异性，与磷脂酸肌醇结合有关[42]，GED结构域与GTPase结构域、中间结构域结合形成二聚体，主要参与多个Dynamin间的相互作用[43]，PRD结构域是多种信号和细胞骨架蛋白相互作用区域[40]，主要将Dynamin招募到内吞位点，协调Dynamin在内吞途径中发挥作用[44]。
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第二章 Dynamin参与EMCV体外感染HeL a细胞
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞、病毒和质粒
本章试验所使用主要细胞株、病毒和质粒见表2.1。
临床医学论文参考
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2方法
2.1 HeLa细胞复苏及传代培养
（1）从液氮罐中取出冻存的HeLa细胞， 37℃快速融化。
（2）300g×离心10min，弃去上清，加入1mL完全培养基，轻轻吹打混匀。
（3）将细胞悬液转移至T25无菌细胞培养瓶，置于细胞培养箱中，37℃、5% CO2条件下培养。
（4）当细胞融合度达到90-95%后进行传代。弃去旧培养液，加入1mL胰酶，倒置显微镜下观察分离成为单个细胞后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀后取1mL细胞悬液加入新的无菌细胞培养瓶中，加入适量完全培养基，于37℃、5% CO2条件下培养。
2.2 Dynamin抑制剂Dynasore浓度筛选
（1）在96孔细胞培养板中接种HeLa细胞进行培养，当细胞融合度达70-80%时，弃去旧培养基。
（2）加入预先配置好20µM、40µM、80µM和160µM 5种不同浓度Dynamin抑制剂Dynasore，每个浓度的抑制剂设3个重复孔，以及一个空白对照组，空白对照组中加入等量DMSO和完全培养基的混合液。
（3）将细胞培养板放入细胞培养箱中于37℃、5% CO2条件下培养24h后，使用Proliferation细胞活力检测试剂盒（Promega）进行细胞活力检测，筛选出不影响细胞活力的最佳Dynasore浓度。
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第三章 Rab5 负向调控 EMCV 感染 HeLa 细胞 ............................. 40
1 材料与方法 .......................... 40
1.1 细胞、病毒和质粒 ................................. 40
1.2 试剂 .............................. 40
第四章 全文结论 ........................... 60
3结果
3.1 EMCV感染HeL a细胞与Rab5有关而与Rab7无关
3.1.1早期内体标志物EEA1、晚期内体标志物LAMP1与EMCV共定位检测
临床医学论文参考
将HeLa细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞融合度达到20-40%时，进行EMCV感染试验，接毒量为10MOI，接毒后37℃孵育1h，弃去含有病毒的上清液，加入2.5% NBS DMEM细胞维持液，放入细胞培养箱中37℃孵育2h和3h，用70%乙醇4℃过夜固定，对目的蛋白及细胞核进行染色。IFA结果显示（图3.1），EMCV VP1蛋白绿色荧光分布在细胞质中，与早期内体标志物EEA1蛋白红色荧光分布位置重合，表明EEA1与EMCV存在共定位。而LAMP1与EMCV并未显示出共定位。综上所述，EMCV病毒粒子侵入HeLa细胞后进入早期内体，而不经过晚期内体。
3.1.2 EMCV感染不同时间段Rab蛋白表达量检测
在检测了EMCV与早期内体、晚期内体的共定位之后，我们选取了早期内体、晚期内体的关键蛋白Rab5蛋白和Rab7蛋白，检测其在EMCV感染不同时间段表达量的变化。在EMCV感染HeLa细胞后，感染后1h、3h、6h和9h分别收集细胞检测Rab5蛋白、Rab7蛋白蛋白表达量和Rab5蛋白、Rab7蛋白基因表达量，以同时间段未感染EMCV的细胞作为对照组。WB检测结果显示，与对照组相比，在感染1h和3h后Rab5蛋白蛋白表达量上升，其余时间段无显著差异（图3.2A, p>0.05），其中1h组间差异显著（图3.2A, p<0.05），3h组间差异极显著（图3.2A, p<0.01），而Rab7蛋白蛋白表达量全时间段无显著差异（图3.2A）。qR T-PCR检测结果显示，与对照组相比，在感染1h后Rab5蛋白基因表达量显著增加（图3.2B, p<0.05），在感染3h后Rab5蛋白基因表达水平极显著增加（图3.2B, p<0.001），其余时间段Rab5蛋白基因表达量无显著差异（图3.2B, p>0.05），而Rab7蛋白基因表达量全时间段均无显著差异（图3.2C, p>0.05）。综上所述，Rab5蛋白的表达量与EMCV感染有关，且主要集中在感染后1h和3h，但Rab7蛋白的表达量与EMCV感染无关。
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第四章 全文结论
1. Dynamin抑制剂Dynasore抑制EMCV感染HeLa细胞，间接说明Dynamin在EMCV感染HeLa细胞过程中发挥作用。
2. 运用慢病毒包装技术构建获得稳定过表达Dynamin的HeLa细胞系HeLa-Dyn2。第10代和第20代HeLa-Dyn2中Dynamin蛋白表达量、基因表达水平高而稳定，对细胞生长活力亦无影响。
3. Dynamin蛋白表达稳定上调后可以显著促进EMCV感染HeLa细胞。蛋白下调会显著抑制EMCV感染HeLa细胞。
4. Dynamin表达量改变不影响感染过程中EMCV吸附HeLa细胞。Dynamin稳定上调后极显著促进EMCV侵入HeLa细胞，表达量下调极显著抑制EMCV侵入，Dynamin还参与EMCV侵入HeLa细胞后的运输过程。
5. EMCV侵入HeLa细胞后进入早期内体，不经过晚期内体。早期内体关键蛋白Rab5主要在病毒感染HeLa细胞3h后发挥作用，晚期内体关键蛋白质Rab7不影响EMCV感染HeLa细胞。
6．Rab5蛋白表达上调后可以显著抑制EMCV感染HeLa细胞，蛋白表达下调会显著促进EMCV感染HeLa细胞。Rab7蛋白表达上调后不影响EMCV感染HeLa细胞，但Rab7蛋白下调后会通过影响Rab5表达量间接抑制EMCV感染HeLa细胞。
7. Rab5和Rab7蛋白不影响EMCV感染过程中吸附HeLa细胞，Rab5蛋白在病毒侵入细胞过程中发挥抑制作用，但Rab7蛋白不影响病毒吸附和侵入细胞。Rab5蛋白不仅参与EMCV侵入HeLa细胞后的运输过程，也参与后续病毒入核，而Rab7不参与EMCV感染HeLa细胞。
参考文献（略）