本文是一篇临床医学论文，本研究使用感染IBV的A549细胞模型，检测免疫抑制剂对病毒增殖的作用效果，筛选出两种具有抗病毒作用的免疫抑制剂，将这两种药物与抗流感病毒药物奥司他韦联合作用，检测联合用药效果。
第一章 引言
1.1 乙型流感病毒(Influenza B virus, IBV)背景介绍
1.1.1 IBV结构特征
IBV为单股负链RNA囊膜病毒，其基因组分为8个节段，编码十余种病毒蛋白。这包括构成RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)复合物的聚合酶酸性蛋白(Polymerase acidic protein, PA)、聚合酶碱性蛋白1 (Polymerase basic protein 1, PB1)和聚合酶碱性蛋白2 (Polymerase basic protein 2, PB2)，基质蛋白1(Matrix protein 1, M1)，离子通道蛋白2(Matrix protein 2, M2)，非结构蛋白1(Nonstructural protein, NS1)，核输出蛋白(Nuclear export protein, NEP)，表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)和NB蛋白以及核蛋白(Nucleoprotein, NP)[1]。其中依赖宿主细胞糖基化修饰的HA与NA蛋白对病毒成熟是至关重要的。在内质网中寡糖逐一连接到HA和NA蛋白中天冬酰胺侧链N原子上组成糖基链，最终产生有活性的HA与NA蛋白。HA与NA糖基化程度的高低与病毒侵染机体后，病毒逃逸宿主免疫系统监视的能力有关[2]。
1.1.2 IBV的复制周期
与IAV结合靶细胞的方式相似，IBV的HA蛋白识别呼吸道上皮细胞膜表面唾液酸受体，结合、吸附与诱导靶细胞对其内吞[3,4]。细胞吞饮病毒颗粒后，酸性环境触发 HA构象改变，使病毒粒子膜与宿主细胞膜融合。同时，酸性环境激活离子通道蛋白BM2，使病毒粒子内部酸化，病毒核糖核蛋白复合体vRNPs与基质蛋白BM1分离释放到细胞质中。vRNPs根据核定位信号入核，病毒基因的复制和转录依赖于RNA依赖的RNA聚合酶(PB1、PB2、PA)。在病毒基因复制过程中，IBV PB2蛋白能够与宿主mRNA的5’ 甲基化帽状结构结合。随后，PA蛋白利用其核酸内切酶活性“抢夺”帽子结构，并置于病毒mRNA的5’ 端起始病毒mRNA的转录。病毒基因转录的mRNA利用宿主蛋白合成机制翻译合成病毒蛋白，与病毒基因组互补的cR NA则作为模板进行子代病毒基因组vRNA复制。新合成的vRNPs在NS2的“牵引”下出核，通过宿主蛋白Rab-11运输至细胞表面，与病毒蛋白共同组装成子代病毒粒子，然后出芽[5]。
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1.2 免疫抑制剂类药物研究进展
器官移植是20世纪生命科学的重大发展，并成为了应对终末器官衰竭的一种有效治疗手段。术后如何长期有效的维持器官功能，降低排斥反应的发生是当前器官移植领域面临的最突出难题。排斥反应是影响异体器官移植患者能否延长存活期的主要影响因素。目前针对排斥反应的首选疗法是长期服用免疫抑制剂类药物，免疫抑制剂是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能抑制与免疫反应有关的细胞因子产生及免疫细胞激活[34]。通过对免疫系统的抑制，免疫抑制剂能在器官移植中起预防和治疗排斥反应的作用。临床常用的免疫抑制剂类药物主要分为4种：①钙调磷酸酶抑制剂(Calcineurin inhibitor, CNI)：例如，他克莫司(Tacrolimus, FK506)和环孢素(Cyclosporin, CsA)；②抗细胞增殖类药物：例如，6-硫鸟嘌呤(6-Thioguanine, 6-TG)和以霉酚酸(Mycopphenlic, MPA)为活性成分的吗替麦考酚酯；③糖皮质激素：例如，地塞米松(Dexamethasone, DXMS)和强的松(Prednisone)；④哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂(Mammalian target of rapamycin, mT OR)抑制剂：例如，雷帕霉素(Rapamycin)及其衍生物依维莫司(Everolimus)。合理的选择免疫抑制药物，可最大程度达到抗排斥反应的效果，以保障移植受者的生活质量。
免疫抑制剂对延长移植器官存活时间极为重要，但是随着免疫抑制剂的长期使用，患者自身机体免疫能力被长期抑制，使器官移植受者在接触多种病原微生物过程中存在较高的感染风险，如疱疹病毒、轮状病毒、丙型肝炎病毒和流感病毒等。这些病毒的感染对器官移植受者将带来严重的后果，甚至死亡。为降低病毒感染对器官移植患者预后的影响，患者在服用免疫抑制剂的同时还需要长期接受预防性抗病毒治疗，不仅加大了患者的身体负担与经济负担，而且随着抗病毒药物的不断使用，耐药毒株的出现几率也随之增加。因此，筛选和研发具有抗病毒作用的免疫抑制剂，将能为应对器官移植受者术后病毒感染提供新的选择。
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第二章 IBV感染激活IFN介导的固有免疫应答
2.1 实验材料及仪器设备
2.1.1 毒株、细胞株
毒株： B/Washingtong/02/2019毒株是商业化疫苗生产用毒株，由本实验室于-80℃冰箱保存。
细胞：犬肾细胞(MDCK)由西北民族大学生物医学研究中心提供。
2.1.2 主要试剂
细胞培养及病毒感染：DMEM培养基及0.25%胰酶-EDTA 购于兰州百灵生物工程有限公司；胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS) 购于兰州民海生物工程有限公司；TPCK处理的胰酶购于美国Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购于Biosharp；T75细胞瓶、6孔板及、96孔板及冻存管购于美国Corning。
RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：Trizol提取裂解液、5%多聚甲醛、DNase/RNase-free ddH2O购于Biosharp；氯仿、异丙醇、无水乙醇购于天津市富宇精细化工有限公司；低熔点琼脂糖购于Sigma；结晶紫购于索莱宝；反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购于诺维赞；PCR管、8连管以及1.5mL RNase-free EP管购于AxyGen。
相关实验药品：JAK-STAT通路抑制剂CP-690550 购于美国Santa Cruz Biotech。使用溶剂DMSO溶解CP，配制为10mM的储存浓度，-20℃储存。
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2.2 方法
2.2.1 细胞复苏培养
将保存在液氮中的MDCK细胞于37℃温水中快速溶解，1000r/min离心6min。弃去上清，用含10% FBS的DMEM培养基重悬后，转移至细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2.2.2 细胞计数及铺板
首先利用双蒸水将细胞计数板和盖玻片清洗干净，放置酒精灯旁烘干，烘干后将盖玻片盖于细胞计数板上。细胞计数板准备好后，将细胞从培养箱取出，PBS洗涤三次，用胰蛋白酶对贴壁细胞消化。待消化好后，加入新鲜细胞培养基，终止消化，采用离心法弃胰蛋白酶，1000r/min 离心5min。随后将细胞重悬，将细胞悬液按照一定比例稀释，吸取适量细胞悬液滴加于细胞计数板与盖玻片的边缘。然后通过显微镜计数，根据计算公式计算出所消化细胞的总数目。六孔板以每孔5×105细胞接种。
2.2.3 TCID50检测IBV毒价
将病毒液10倍倍比稀释（10-1至10-11），稀释液接种于生长 80% -90% 贴壁细胞MDCK的96孔细胞培养板。置于37℃浓度为5%的CO2培养箱中培养，逐日观察记录细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE)。采用Reed-Muench法计算病毒的组织半数感染量 (50% tissue culture infection dose，TCID50)： TCID50=高于50%病变的最高稀释度+确切稀释倍数 确切稀释倍数=(高于50%的百分数-50%) ÷ (高于50%的百分数-低于50%的百分数)
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第三章 MPA 和 6-TG 抗 IBV 感染的作用研究 ........................ 23
3.1 实验材料及仪器设备 ........................ 23
3.1.1 毒株和细胞株 ............................. 23
3.1.2 相关实验试剂 ................................ 24
第四章 全文总结 .............................. 42
第三章 MPA和6-TG抗IBV感染的作用研究
3.1 实验材料及仪器设备
3.1.1 毒株和细胞株
毒株：同2.2.1
细胞：犬肾细胞(MDCK)、人类非小细胞肺癌细胞系(A549)、人胚胎肾细胞(HEK 293T)由西北民族大学生物医学研究中心提供。
3.1.2 相关实验试剂
药品：霉酚酸(MPA)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、他克莫司(Tacrolinus)、依维莫司(Everolimus)、雷帕霉素(Repamycin)、环孢素A(CyclophilinA)、强的松(Prednisone)、地塞米松(Dexamethasone)、Guanosine、MG132购于Aladdin；奥司他韦(Oseltamivir)购于MCE。除奥司他韦溶解于ddH2O中，其它药物溶解在DMSO中，并储存于-20℃。使用时通过在新鲜培养基中稀释储存液制备药物的最终工作浓度。
相关试剂与材料： Opti-MEM购于Gibco；lipofectamine 2000转染试剂购于Invitrogen；BCA试剂盒、蛋白质Marker购于赛默飞；质粒PCMV-C-Flag、蛋白裂解液(RIPA)购于碧云天； 30%聚丙烯酰胺制胶液、ECL化学发光液、蛋白酶抑制剂(PMSF)及4×蛋白上样缓冲液购于Biosharp； 兔源IBV-HA抗体、兔源IBV-NP抗体购于GeneTax；兔源GAPDH抗体、山羊抗兔IgG购于中杉金桥；质粒小量提取试剂盒、Tris-base、Glycine、SDS、MTT购于索莱宝；无缝克隆试剂盒购于诺维赞。
临床医学论文参考
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第四章 全文总结
IBV感染宿主后，宿主免疫系统作为抵抗病毒入侵的第一道防线，会立即被激活，促进炎症因子产生。而免疫抑制剂的作用主要是抑制免疫系统的活化，减少炎性因子的产生。为探究免疫抑制剂与IBV之间的作用关系，本研究使用感染IBV的MDCK细胞作为模型，检测病毒感染后固有免疫的激活。使用感染IBV的A549细胞模型，检测免疫抑制剂对病毒增殖的作用效果，筛选出两种具有抗病毒作用的免疫抑制剂，将这两种药物与抗流感病毒药物奥司他韦联合作用，检测联合用药效果。
1. IBV感染细胞有效激活I型及Ⅲ型IFN介导的JAK-STAT信号通路发挥抗病毒作用。
2. 筛选四类免疫抑制剂，其中钙调磷酸酶抑制剂、糖皮质激素、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂三类免疫抑制剂对病毒增殖无抑制作用。
3. MPA通过抑制细胞内鸟苷酸从头合成，导致病毒RNA合成原料不足，实现对IBV增殖的抑制；6-TG通过促进泛素-蛋白酶体途径对病毒糖蛋白HA降解，实现对IBV增殖的抑制。
4. MPA与抗流感病毒药物奥司他韦联合作用，在抗病毒过程中呈现拮抗的药物效果；6-TG与奥司他韦联合作用，在抗病毒过程中呈现协同的药物效果。
参考文献（略）