第一章 文献综述
1.1 狂犬病的流行和危害
狂犬病又称恐水症，是一种古老的、给人类造成巨大危害的人畜共患传染病，人和动物发病后，死亡率接近 100%(Albertini et al2011; Davis et al 2015)。在世界范围内，每年至少有 59000 人死于狂犬病，每 10min 左右就有一个人因狂犬病而死亡，严重威胁着 150 多个国家和地区超过 3 亿人的生命安全(Lankester et al 2014; Wunner and Briggs 2010)。2015 年 12 月，世界卫生组织（World health organization，WHO）在瑞士日内瓦举行的全球狂犬病大会上呼吁到 2030 年消除犬介导的人类狂犬病(Mohammadi 2016)。由此可见，控制和消除狂犬病迫在眉睫。公元前 556 年，古代中国首次发现并记录了狂犬病(Ruan 2017)，现在依然是我们国家一个非常重要的公共安全问题。狂犬病报告死亡人数一直仅次于乙肝和艾滋病，高居我国各类传染病报告死亡人数的前三位(Tang et al 2005; Zhang etal 2005)。我国每年狂犬病死亡人数仅次于印度，位列世界第二位(Zhou et al2016a)。20 世纪 60 年代以来，我国出现了两次狂犬病流行高峰：第一次是在 80年代初期，1981 年是新中国成立以来死亡人数最高的一年，全国报告死亡人数为 7037，整个 80 年代，年死亡人数均保持在 4000 以上，平均每年 5537 例，1996年降到最低水平 159 例，随后死亡人数迅速增长；第二次高峰是在 21 世纪初期，2003 年全国发病人数突破 2000，2007 年死亡人数高达 3300，之后逐年下降，2010年、2011 年、2012 年和 2015 年死亡人数分别为 2014、1918、1361 和 804（图1-1）(Tan et al 2017; Tao et al 2015; Zhou et al 2016a)，上述疫情报告表明目前我国狂犬病疫情呈下降趋势，但依然较为严重。狂犬病的流行不仅严重威胁人们的生命安全，而且给人们带来了严重的心理影响，目前我国恐狂人数一直居高不下。每年，我国用于狂犬病预防和暴露后治疗的费用在 100 亿人民币以上，给社会带来了沉重的经济负担。我国狂犬病专家提议在 2020 年前消除人类狂犬病(Song etal 2014)，并接受了大健康（One health）这一新概念，提倡政府、新闻和医疗等多个机构共同应对狂犬病(Tan et al 2017)，为消除狂犬病指明了方向。WHO 调查发现免疫犬的覆盖率只要达到 70%就可有效减少 RABV 的传播，从而控制人类狂犬病(Organization 2013)。我国犬只数量非常巨大，大多分布于偏远的农村地区且多数为流浪犬，因此，预防和消除狂犬病依然是我国要面临的巨大挑战。
...........
1.2 狂犬病病原学
狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）是引发狂犬病的病原，属于单负病毒目（Mononegavirales）弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）单股负链不分节段的 RNA 病毒，其基因组相对比较简单，大小为 11928 nt 左右，从RABV基因组的3′到5′端依次编码5个结构蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、表面的糖蛋白（G）和 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（L）(Albertiniet al 2011; Davis et al 2015)（图 1-2）。基因组 3′端的起始密码子上游 8~26 nt 存在保守的 UUGC 序列，是 mRNA 合成的起始位点，参与 5′端帽子结构（GpPPAmACA）的形成。3′端 N 基因前面具有一段先导 RNA 序列（LeaderRNA），长度是 58 nt；各基因之间都具有一定长度的间隔序列(Wunner et al 1988)，G基因和L基因之间具有一段不表达的假基因序列，大小约520 nt，其功能未知，但删除该假基因对 RABV 的表型没有影响，是理想的外源基因插入区(Ertl 2009;Zhao et al 2009; Zhao et al 2010)。N 蛋白将 RABV 基因组包裹，使基因组不能接触到细胞成分；P 蛋白是 RNA 聚合酶共因子和 N 蛋白的伴侣蛋白；M 蛋白参与病毒的组装和出芽；G 蛋白是膜蛋白，参与受体的识别和膜溶解；L 蛋白是病毒RNA 聚合酶，主要负责 RABV 的转录和复制；RABV 的 RNA、N 蛋白、P 蛋白和 L 蛋白形成核糖核蛋白体（Ribonucleoprotein，RNP），RNP 是 RABV 转录和复制的核心部分(Jackson 2011)。
..........
第二章 目的与意义
2.1 DC 作为主要的抗原提呈细胞，在体液免疫中发挥重要作用。HMGB1 是一种DC 成熟分子，正常情况下主要定位于细胞核内。为了获得高效的狂犬病弱毒活疫苗，我们将 HMGB1 进行了一些突变，使其分泌到细胞外。利用 RABV 反向遗传操作系统和小鼠模型，研究野生型和突变型 HMGB1 对 RABV 诱导的体液免疫反应的影响，并进一步研究其作用机制。
2.2 Tfh 细胞是体液免疫反应中非常重要的一种辅助性 T 细胞，能够促进生发中心 B 细胞的发育和分化，是目前体液免疫反应研究的热点。CXCL13 具有招募Tfh 细胞和 B 细胞的作用。我们提出科学假设，CXCL13 可能促进 RABV 诱导的体液免疫反应。基于该设想，利用 RABV 反向遗传操作系统和小鼠模型，探究CXCL13 在 RABV 诱导的体液免疫反应中所起到的作用并阐述其作用机理，为开发新型狂犬病疫苗奠定理论基础，提供新思路。
.........
第三章 HMGB1 促进狂犬病病毒诱导的体液免疫反应..........28
3.1 材料与方法...........28
3.2 结果与分析..........46
3.2.1 表达 HMGB1mut重组 RABV 的获得及特性 .....46
3.2.2 表达 HMGB1mut促进骨髓源树突状细胞的成熟 .......52
3.2.3 表达 HMGB1mut促进 DCs 的成熟和/或招募....54
3.2.4 表达 HMGB1mut促进 Tfh 细胞的激活......54
3.2.5 表达 HMGB1mut促进生发中心 B 细胞的激活...........56
3.2.6 表达 HMGB1mut促进浆细胞的激活 .........59
3.2.7 LBNSE-HMGB1mut的致病性和免疫原性 .........60
3.3 讨论....62
第四章 CXCL13 促进狂犬病病毒诱导的体液免疫反应..........66
4.1 材料与方法...........66
4.2 结果与分析...........74
4.2.1 表达鼠源 CXCL13 重组 RABV 的构建及特性 .........74
4.2.2 表达鼠源 CXCL13 利于引流淋巴结的生长发育.......76
4.2.3 表达鼠源 CXCL13 利于生发中心的形成..........76
4.2.4 血浆 CXCL13 浓度与生发中心活性和病毒中和抗体正相关.....80
4.2.5 表达 CXCL13 促进浆细胞的激活....81
4.2.6 LBNSE-CXCL13 的免疫原性...........83
4.3 讨论....84
第五章 全文结论..........88
第四章 CXCL13 促进狂犬病病毒诱导的体液免疫反应
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.1.1 质粒、细胞和病毒
参见第三章材料方法。
4.1.1.2 抗体及重组
蛋白鼠源 CXCL13 重组蛋白及其 ELISA 试剂盒，购自美国 R&D Systems 公司；小鼠调节性 T 细胞染色试剂盒，购自美国 eBioscience 公司；流式细胞术用到的抗体如下：FITC标记抗鼠CD2（0clone SA275A11）、PE标记抗鼠Ki-6（7clone 16A8）和 APC 标记抗鼠 Bcl-6（clone 7D1），购自美国 Biolegend 公司（San Diego，CA）。淋巴结免疫荧光用到的抗体如下：Alexa Fluor 647 标记抗鼠 CD45R/B220（cloneRA3-6B2）、Alexa Fluor 488 标记抗鼠 IgG（clone Poly4053）和 Alexa Fluor 594标记亲和链霉素，购自美国 Biolegend 公司；生物素标记的抗鼠 GL7（clone GL7）购自美国 eBioscience 公司。其余抗体参见第三章材料方法。
..........
结论
5.1 表达 HMGB1mut轻微限制了 RABV 的增殖（滴度下降 0.5 Log FFU/ml），抑制了 RABV 诱导的细胞凋亡，但对细胞活性没有影响。表达 HMGB1mut促进了BMDCs 和机体 DCs 的成熟，进而促进了机体内 Tfh 细胞、GC B 细胞和浆细胞的激活。LBNSE-HMGB1mut能够快速诱导机体产生高水平的病毒中和抗体，提供机体较高的保护，且对小鼠没有明显的危害作用；LBNSE-HMGB1mut免疫效果优于亲本病毒 LBNSE 和 LNBSE-HMGB1wt，可作为狂犬病疫苗的候选者。
5.2 LBNSE-CXCL13 与亲本病毒 LBNSE 和 LBNSE-GM-CSF 在体外和体内的生长特性没有差异。LBNSE-CXCL13 表达的 CXCL13 在体外和体内均具有生物学活性，均能够招募表达其受体 CXCR5 的细胞（Tfh 细胞和 B 细胞），并促进引流淋巴结的生长发育和生发中心的形成。表达 CXCL13 的重组 RABV 比亲本病毒LBNSE 和 LBNSE-GM-CSF 招募更多的 GC B 细胞，进而激活更多的浆细胞，促进病毒中和抗体的产生，并提供机体较高的保护；结合先前的研究，LBNSE-CXCL13 免疫效果略优于 LBNSE-GM-CSF，是一个良好的狂犬病弱毒疫苗。此外，CXCL13 的血浆浓度、RABV 中和抗体滴度和 GC 活性三者之间极显著正相关，CXCL13 是检测 RABV 诱导的体液免疫反应的一个血浆标志。
..........
参考文献（略）