本文是一篇临床医学论文，本研究建立了生物学特性良好、核型正常、对脑心肌炎病毒敏感的三株人胚肺成纤维细胞系，具有进一步研究和应用的价值。
第1章文献综述
1.1人二倍体细胞
人二倍体细胞（Human diploid cells，HDCs）因染色体数目与供体组织保持一致，无致瘤性，对多种人源类病毒易感，生物安全性较好，被称为生产人用病毒性疫苗最理想的细胞基质。
1.1.1国内外研究现状
20世纪60年代初，Hayflick和Moorhead从19个流产胚胎的肺、皮肤、肌肉、肾脏、心脏、甲状腺、胸腺和肝脏等组织建立了25株人二倍体细胞[1]，分别命名为Wistar Institute 1～25（WI-1～WI-25）。研究发现人胚肺细胞在经50次群体倍增后停止复制，此时它仍保留了来源组织的二倍体核型，且并未发现内、外源病毒污染。人二倍体细胞系的建立开启了人用病毒类疫苗生产细胞基质的人源化时代。随后，Hayflick又建立了可在体外群体倍增48次的WI-38细胞株[2]。WI-38来源于一个妊娠3月龄的流产胚胎，其父系及母系三代均无明显遗传病史，Hayflick将其提供给多家疫苗生产企业，是世界上第一株被许可用于人用病毒类疫苗生产的人源细胞株。此后，在很长的一段时期内，以WI-38细胞为基质生产了多种安全性和免疫原性良好的人用病毒类疫苗，包括脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、水痘疫苗、带状疱疹疫苗、腺病毒疫苗、狂犬病疫苗和甲型肝炎疫苗等[3,4]。1966年，英国科学家Jacobs参照WI-38细胞建立方法，从14周龄的正常男胎肺组织中成功分离细胞后建立了MRC-5细胞株[5]，其原始种子库为P7代，该细胞库被英国国家生物制品检定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）批准用于人用病毒类疫苗的生产。由于WI-38细胞株面临细胞种子逐渐减少，且部分种子细胞后期被发现存在污染的问题，现在主要以科学研究为主，已基本不用于疫苗的生产。从此，MRC-5细胞株代替WI-38细胞成为人用疫苗生产最广泛的细胞基质[6]。为了确保MRC-5细胞在疫苗研发和生产中的持续供应，2006年NIBSC以原始种子库P7为基础，建立了P12代种子库，经全面的评估后满足疫苗生产要求，使用单位用该种子库可制备主细胞库和工作细胞库以用于疫苗生产[7]。WI-38和MRC-5细胞是目前被世界卫生组织（World HealthOrganization，WHO）推荐的人二倍体细胞国际参考株。
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1.2人胚肺细胞的分离培养
1.2.1胚胎样本的选择
人胚肺细胞来源于健康的人胚胎，了解胚胎发育过程，是建立生长特性良好且符合生产要求的人胚肺细胞系的基础。精子和卵子结合形成受精卵，在母体内经细胞增殖、生长、分化等一系列过程，最终形成组织器官并发育成胎儿。胚胎的发育过程一般分为胚前期、胚胎期和胎儿期三个阶段[17]，期中受精后0~2周内称为胚前期，2~8周内为胚胎期，8周以上为胎儿期。胚前期受精卵不断分裂形成桑葚胚继而形成胚泡，并植入子宫内膜，此时胚体体型尚未形成。胚胎期是指第2~8周的发育阶段，期间胚体生长分化迅速，胚体形体及基本器官均已初步形成。第2周开始，胚胎开始迅速发育，脊椎、脑组织、脊髓、神经系统、眼睛开始初见雏形，第4周时，心脏、肺、肝也开始发育，至第8周末，胚胎所有器官系统均已初步形成[18,19]。胎儿期指的是第9周开始至胎儿出生的阶段，此阶段胚胎迅速生长，雏形器官组织成形分化，其中第3-4月的胚胎生长最为迅速，第5月开始胚胎生长速度开始减慢[20]。通常情况下3~4月龄的胚胎是最理想的人胚肺细胞系组织来源，根据胚胎发育进程，第9周以后肺组织已分化成形，也可用于细胞系的建立。
1.2.2培养条件的研究
为了满足工业化培养的需要和成本综合考虑，对于有应用前景的细胞系，建系后须研究其最佳培养条件，包括培养基、动物血清、传代比例等。
（1）培养基
培养基是维持细胞生长的营养物质，可以在体外维持细胞存活并促进细胞增殖。根据培养基的来源和成分，目前可分为天然培养基、合成培养基和无血清培养基三大类[21,22]。其中，天然培养基主要是指动物体液和组织提取液，如鸡胚浸出液、血浆、血清、淋巴液等，这是最早使用的培养基。虽然天然培养基营养丰富、培养效果好，但其存在制备工艺复杂、资源有限、批间差较大和生物安全风险高等诸多缺陷，无法满足细胞实际生产应用的需求，随后逐渐被人工合成培养基所取代。合成培养基是通过对天然培养基成分分析的基础上建立的人工配方的培养基，其主要成分是水、氨基酸、维生素、糖类、无机离子和一些辅助因子等，使用时需添加一定量的天然培养基后才能正常培养细胞。目前，已上市使用的合成培养基种类繁多，常见的合成培养基有MEM、DMEM、DME/F12、M199、RPMI-1640等，每种培养基根据使用需要的不同，在基本配方的基础上通过优化产生了诸多系列商品化产品。无血清培养基是在合成培养基的基础上，加入成份完全明确的天然培养基的替代成份，使用时再无需添加天然培养基可满足细胞正常培养的需求[23]。无血清培养基既能满足动物细胞培养的要求，又能有效克服使用天然培养基潜在的生物安全风险，而且其成份相对明确，有利用于生物制品的下游纯化，故使用范围越来越广。人二倍体细胞为贴壁培养型细胞，无血清培养基成本较高，常选用合成培养基添加动物血清进行培养。
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第2章人胚肺成纤维细胞系的建立及培养条件的研究
2.1材料
2.1.1样本
在通过伦理审查的前提下，根据《中国药典》三部（2020版）中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的要求收集人工流产胚胎及相关资料，包括胎儿的胎龄、性别、父母的年龄、职业及健康证明（应健康状况良好），且胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病史。
2.1.2主要试剂与材料
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2.2实验方法
2.2.1样品收集
从医院收集正常人工流产胚胎，要求：1）胎龄为11周以上4月龄以内；2）胎儿父母健康状态良好，且父系及母系三代无明显遗传缺陷疾病。胚胎流产后立即放入无菌标本袋，置于含冰袋的泡沫盒，在6 h内送到实验室。
2.2.2原代细胞的分离和命名
利用75%的酒精将标本袋表面进行全面消毒，无菌条件下取出胚胎。用PBS冲净胚胎表面血渍和黏液，放入75%酒精中浸泡3次，每次约1 min。置超净工作台约10 min风干表面后，解剖胚胎胸腔，分离肺组织。将肺组织转移到50 mL烧杯中，用眼科剪将其剪成1～3 mm3大小的碎块，加入PBS漂洗至液体澄清。转移组织碎块至含玻璃珠的50 mL锥形瓶内，加入约10倍组织量的0.25%胰蛋白酶，于37℃水浴锅消化20～30 min，期间每隔5-10 min轻轻摇动锥形瓶，使组织块胰蛋白酶充分接触。消化结束，弃上清，加入含15%GF的MEM培养液终止消化，用力摇动锥形瓶进一步分离胚肺细胞，将细胞悬液经100目细胞筛网过滤，收集细胞，1×105 cells/cm2接种至细胞培养瓶若干，补充含15%GF的MEM培养液，标记为P0代，置于37℃，5%CO2培养箱培养。培养6 h后可观察细胞生长情况，细胞贴壁后更换新鲜的细胞培养液继续培养，细胞长满单层即可进行传代培养。
细胞命名为MU-Ls，其中MU为分离保存单位民族大学的英文MinzuUniversity简写，L为细胞来源组织肺的英文Lungs第一个字母，s为样本顺序号，第一个样本分离的肺细胞命名：MU-L1。
2.2.3传代扩大培养
细胞长满单层，弃掉原培养液，加入适量0.25%的胰蛋白酶，消化约1min，待细胞间出现明显间隙后弃掉胰酶，将培养瓶放入37℃恒温培养箱中约1min，消化至细胞完全脱落，加入含15%GF的MEM培养液终止消化，轻微吹打细胞悬液使细胞分散均匀，按1:2分种率传代，标记为P1代，置于37℃，5%CO2培养箱培养。P1代细胞长满单层，选择生长状态良好的细胞，按照常规方法消化，按1:4分种率传代扩大培养，标记为P3代。
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第3章 人胚肺成纤维细胞系生物学特性的研究 .......................... 24
3.1 材料 .................................. 24
3.1.1 细胞 ................................. 24
3.1.2 实验动物 ....................... 24
第4章 SV40-LT转染人胚肺成纤维细胞永生化的初步研究 ............ 44
4.1 材料 ........................... 44
4.1.1 细胞 ................................... 44
4.1.2 毒株 .................................... 44
第5章 全文结论 .......................... 60
第4章SV40-LT转染人胚肺成纤维细胞永生化的初步研究
4.1材料
4.1.1细胞
人胚肺成纤维细胞系（MU-L1、MU-L2、MU-L3）由第2章2.2.2分离所得；标准对照细胞：BHK21细胞由西北民族大学甘肃省动物细胞技术创新中心提供。
4.1.2毒株
脑心肌炎病毒（EMCV）由西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室提供。
4.1.3材料
临床医学论文参考
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第5章全文结论
1.本研究成功建立了MU-L1、MU-L2和MU-L3三株人胚肺成纤维细胞系，分别能传P67、P77和P75代。
2.三株人胚肺成纤维细胞均符合人二倍体细胞的生长特性，具有正常人二倍体核型，无细菌、真菌、支原体和内外源病毒因子污染，未发生细胞间交叉污染，无成瘤性，对EMCV具有敏感性，且病毒滴度均高于标准对照株MRC-5。
3.本研究利用慢病毒转染技术构建了MU-SVL1、MU-SVL2和MU-SVL3三株稳定过表达SV40-LT基因的人胚肺成纤维细胞，现已分别连续培养至P90、P91、P89代。三株稳转细胞系随着细胞代次的增加，有多倍体（2n＞53）发生，均无成瘤性。
综上，本研究建立了生物学特性良好、核型正常、对脑心肌炎病毒敏感的三株人胚肺成纤维细胞系，具有进一步研究和应用的价值。利用慢病毒转染技术构建了稳定过表达SV40-LT的人胚肺细胞系，初步验证其生命代次明显延长，人胚肺细胞系永生化是有可能实现的。
参考文献（略）