第一篇 文献综述
第 1 章 TLR4 与 NF-κB 炎性通路
Toll 样受体（toll like receptors，TLRs）是一类在天然免疫系统中通过活化促炎性信号通路对微生物病原体起作用的模式识别受体。TLR4 是最具特征的TLR，与革兰氏阴性菌细胞壁的 LPS 结合。根据结合 LPS 到 TLR4 和共同受体CD14 和 MD-2，适配器蛋白髓样分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）进入到 Toll/IL-1 受体（TIR）区域[1]。TLR4 的 TIR 区域和 MyD88 相互作用引发下游信号串联，导致核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路的活化，然后活化编码促炎性分子包括天然免疫反应中的细胞因子，趋化因子和其他效应器的促炎性基因的转录。
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1.1 TLRs 的作用及应用
1.1.1 TLRs 的生物学功能
TLRs 是一类病原识别受体（pathogen recognition receptors，PRRs），它能识别病原相关的分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。人的体内总共有 10 种 TLR 基因。TLRs 主要表达于细胞表面，或者与细胞内囊泡结合，如胞内体[2]。TLR1，TLR2，TLR4，TLR5 和 TLR6 分别结合它们的细胞表面配体并识别微生物膜组件，如脂质，脂蛋白和蛋白。TLR3，TLR7，TLR8 和TLR9 主要存在于细胞内囊泡，如胞内体或溶酶体和内质网，主要是识别微生物核酸[2]。TLR4 是人类第一个识别细菌脂多糖的 TLR，LPS 主要由胞膜外的革兰氏阴性菌组成。LPS 是一个表面暴露的糖酯，主要由疏水性膜组成，现在已知的主要是脂质 A。脂质 A 的变体对一些逃避免疫检测的革兰氏阴性菌有一定作用[3]。光滑型 LPS 是由多聚糖 O-抗原边链组成的并且有完整的核心低聚糖，然而粗造型LPS 缺乏 O-抗原并且有短的核心低聚糖[2]。在细胞表面，MD-2 与 TLR4 密切相关并且在 LPS 刺激的相关炎性因子的产生过程中有重要的作用。LPS 结合蛋白（LPS-binding protein，LBP）和 CD14 都是在 TLR4 介导的 LPS 刺激性反应中产生的[2]。缺乏 CD14 的细胞对光滑型 LPS 没有反应，但是对粗造型 LPS 或者脂质A 有反应[2]。
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1.2 NF-κB 炎性通路
炎性疼痛是由一些疼痛介质引起的，如促炎性因子、前列腺素和缓激肽[51, 52]。已有文献确定了 TLRs 是炎性和神经性疼痛的一个重要媒介[53, 54]。TLRs 是识别外源性异物（如细菌和病毒）的模式识别受体（PAR）。用外源性配体如脂多糖（LPS）或者分支杆菌刺激机体，能活化 TLR4 并引起疼痛[55]。在有神经性病变的小鼠中敲除 TLR2 或者 4 能减少疼痛感[56, 57]，这表明了 TLR 是通过外源性配体如热激蛋白活化的。NF-κB 是许多生理和病理过程的重要核转录因子，比如在免疫，炎性，致癌和药物抗性方面[58, 59]。在哺乳动物，NF-κB 家族由 5 个相似结构的蛋白组成，RelA（p65）、NF-κB-1（p105/p50）、NF-κB-2（p100/p52）、RelB 和 c-Rel，这些都会形成不同的同源二聚体和异源二聚体[60]。NF-κB 的主要形式是由 p50 和 p65亚基组成的。在大多数细胞中，NF-κB 主要结合到 NF-κB 抑制剂（inhibitor ofNF-κB，IκB）上以非活化形式存在于细胞质中。TNFα 或者 IL-1β 导致 IκB 激酶（IκB kinase，IKK）活化。活化的 IKK 磷酸化 IκB 蛋白并且引发了 IκB 的泛素化和降解，从而导致 p50/p65 异源二聚体的释放，转移到核内作为一个序列特异性 DNA 结合转录因子。同时，IKK 磷酸化 p65 的 Ser536 位点，因此增强了 NF-κB的活性[61]。另外，在某些细胞中，化疗介导的 DNA 损伤能通过膜受体的细胞外配体信号激活 NF-κB[62]。
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第 2 章 胰岛素抵抗
2.1 与胰岛素抵抗有关的因素
胰岛素抵抗常见于怀孕后期和哺乳初期。怀孕动物周围组织对葡萄糖的利用率远远低于非怀孕和非哺乳期动物。在母羊怀孕后期，胎儿对葡萄糖的摄入大约占葡萄糖产生的 42%-50%。怀孕鼠的心肌，白色和灰色脂肪对葡萄糖摄入量和GLUT4 的表达远远低于非怀孕鼠。一项关于母羊的研究中，Schlumbohm（1997）表明，怀孕期间骨骼肌和脂肪组织中胰岛素介导的葡萄糖摄入和胰岛素介导的抑制脂肪分解都低于非怀孕和哺乳期的母羊[114]。在妊娠后期，血清中激素雌二醇、孕酮和催乳素浓度的增加影响了周围组织对胰岛素的敏感性。Ryan 和 Enns（1988）表明了这些激素对怀孕，非怀孕，未经生育鼠的脂肪细胞中胰岛素的作用[115]。总的来说，从母体到胎儿的葡萄糖转运是一个非胰岛素依赖性过程，然而，葡萄糖从血液转运至肌肉或者脂肪组织，肌肉或脂肪组织转运至血液是胰岛素依赖性过程。怀孕后期周围组织对胰岛素敏感性降低确保了母体到胎儿葡萄糖的充足转运。如果通过胰岛素敏感组织对胰岛素刺激的葡萄糖利用不受限制，在低血糖的情况下胎儿可能不会存活。
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2.2 NAFLD 与胰岛素抵抗
全球新型医疗保健面临着很大的挑战并且跟以前截然不同，主要是因为全球糖尿病普遍增加。这些主要体现在对肥胖关注点的变化—与肝脏疾病相关。虽然病毒性肝炎依然是重要的健康问题，非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）现在在西方国家也是常见的肝脏紊乱性疾病，在美国，成年和儿童肥胖率已经飙升到20-30%。在亚洲的东部和南部地区，NAFLD 的发病率依然在升高，估计市区的发病率可以达到 60%左右。现在已经在南亚的印度人中发现了 NAFLD 在瘦的年轻人中也渐渐流行[123, 124]。已经有研究表明，NAFLD 和Ⅱ型糖尿病之间有密切的联系：90%的Ⅱ型糖尿病肥胖病人伴有 NAFLD[125, 126]。这两种疾病往往都会伴发胰岛素抵抗[124]。有NAFLD 的病人经常伴有胰岛素抵抗，增加了Ⅱ型糖尿病的风险[124, 127, 128]。另外，有一部分 NAFLD 患者会发展成非酒精性脂肪性肝炎（NASH），伴发着组织学变化，如脂肪变性，小叶炎症和/或肝细胞膨胀[129]。患有 NASH 大约 20%的病人会发展成肝硬化或肝功能衰竭[130, 131]。NASH 相关的肝硬化是美国现在肝脏移植的第三大常见指征[132]。我们了解肝脏脂质积聚和肝脏胰岛素抵抗之间的联系，主要集中在二酰甘油的作用，二酰甘油是一个可以活化新的蛋白激酶 C 亚基（PKCs）然后修复胰岛素信号的脂质代谢产物，其在脂质介导的肝脏胰岛素抵抗的发病机理中发挥重要作用，在其他的机制中已经解释了这种联系[133]。
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第 2 章 NEFAs 通过 NF-κB 炎性信号通路影响.......45
2.1 材料与方法 .......46
2.2 结果....48
2.3 讨论....53
2.4 小结....54
第 3 章 NEFAs 影响犊牛原代肝细胞的脂质代谢...........55
3.1 材料与方法 .......55
3.2 结果....58
3.3 讨论....62
3.4 小结....65
第 3 章 NEFAs 影响犊牛原代肝细胞的脂质代谢
围产期奶牛是由于干物质摄入减少和能量需求增加而导致适应性能量负平衡。为弥补能量亏欠，机体启动脂肪动员，使循环血液中的 NEFAs 和 BHBA显著增加。一旦进入肝脏的 NEFAs 超过其氧化能力，则会以 TG 的形式在肝脏蓄积。BHBA 是奶牛酮体的主要形式，主要是由于 NEFAs 在肝脏中不完全氧化产生的。肝脏产生的 BHBA 超过肝外组织利用能力则可引发酮病。能量负平衡引发的血液中游离脂肪酸增加可抑制葡萄糖刺激胰岛素分泌的作用，并且抑制肝细胞和胰岛素的结合，限制肌细胞葡萄糖转运蛋白的活性，以致发生胰岛素抵抗[226, 227]。因为肝脏是胰岛素活性的主要作用器官，当肝脏功能紊乱时，胰岛素的敏感性也会改变而诱发胰岛素抵抗[228]。肝脏是调节脂质代谢和保持脂质稳态的重要器官。PPARα，SREBP-1c 和ChREBP 是调节脂质代谢的三个关键核转录因子，这三个因子都能控制脂质代谢关键酶的表达。围产期能量负平衡奶牛存在肝脏糖脂代谢紊乱，但其调节途径和机制还有待进一步证实。我们推测高浓度的 NEFAs 可能会引起肝细胞的脂质沉积，并且体内肝脏脂质沉积与酮病有很大关系。因此，本实验分离培养犊牛原代肝细胞经 NEFAs 处理，评价 NEFAs 对肝细胞脂质代谢产生影响。另外，通过研究脂肪肝病羊模型的三个核转录因子的表达量进一步确定脂肪肝的脂质代谢特征。
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结 论
1. NEFAs 能与犊牛原代肝细胞表面的 TLR4 结合激活 NF-κB 炎性通路，增加促炎性因子 IL-6 和 TNF-α 的表达。
2. NEFAs 可通过激活犊牛原代肝细胞的 NF-κB 炎性通路来抑制奶牛肝细胞的胰岛素通路，增加肝脏糖异生的水平，降低肝脏糖元合成，降低胰岛素的敏感性，从而引起胰岛素抵抗。
3. NEFAs 能通过作用于三个核转录因子 SREBP-1c，PPARα 和 ChREBP 来调节脂代谢，增加了脂合成基因的表达，降低了脂氧化基因的表达，并且体内实验进一步证实了脂肪肝病羊肝脏中脂合成明显增加。
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参考文献（略）