1 材料与仪器
1.1 主要材料与试剂
1.1.1 纯钛表面抗菌肽 GL13K 涂层及抗腐蚀性能检测实验
纯钛片（Alfa Aesar，美国）；抗菌肽 GL13K（上海强耀生物科技有限公司，中国）；丙酮（上海成海化学工业有限公司，中国）；氢氧化钠（西陇化工股份有限公司，中国）；碳酸钠（西陇化工股份有限公司，中国） ；戊二醛（西陇化工股份有限公司，中国）；环己烷（西陇化工股份有限公司，中国） ；叔丁醇（Sigma-aldrich，美国） ；无水乙醇（Sigma-aldrich，美国）；无水戊烷（Sigma-aldrich，美国） ；95% 3-氯丙基三乙氧基硅烷（Sigma-aldrich，美国）；N,N-二异丙基乙胺（上海沃凯药业有限公司，中国）；去离子水（Million-Q distilled water 18.2m Ω-cm；美国）；乳酸（分析纯,浓度 90%，天津市福晨化学试剂厂, 中国）；人工唾液（ISO/TR，AMEKO，上海联硕生物科技有限公司, 中国）；
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1.2 主要实验仪器
电感耦合等离子体质谱仪（7900，Agilent，美国）；饱和甘汞电极（232 型，上海兢羽中电子科技发展有限公司，中国）；铂电极（213 型，上海兢羽中电子科技发展有限公司，中国）；铂片电极夹（JJ110，上海兢羽中电子科技发展有限公司，中国）；三孔电解池（C002，上海兢羽中电子科技发展有限公司，中国）；恒温磁力搅拌机（S21-3，上海司乐科技有限公司，中国）；电化学工作站（AutoLab PGSTAT302, Metrohm, Swiss）；CO2 培养箱（BB5060UV，Heraeus，德国）；Hfsafe-1200 型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，中国）；MVE 液氮罐（CRYO-SYSTEM4000，Forma，美国）；电子天平（ML204，梅特勒-托利多仪器有限公司，中国）；高速冷冻离心机（CF16RXⅡ，日立工机有限公司，日本）；全自动细胞计数仪（Countstar IC+1000，上海睿钰，中国）；超低温冰箱（MDF-U53V；SANYO，日本）；纯水系统（PURELAB，威立雅-莱特莱德，英国）；加热磁力搅拌器（RCT B S-25，IKA，德国）；紫外分光光度计（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国）；PH 计（S20K，梅特勒-托利多仪器上海有限公司，中国）；真空干燥箱(ST-1600C，上海精宏设备有限公司，中国）；冷冻干燥机（FD-1E-50，上海精宏设备有限公司，中国）；超声振荡器（FS-200T，Thermo-Fisher Scientific Inc，美国）；高压灭菌锅（LDZM-40KCS，上海沪粤明科学仪器有限公司，中国）；荧光倒置相差显微镜（Olympus，日本）；流式细胞仪（Accuri C6，BD，美国）。
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2 实验方法
2.1 钛表面涂层抗菌肽 GL13K 涂层
抗菌肽 GL13K，是将腮腺分泌蛋白衍生物进行人工改造合成的抗菌肽，可模拟天然宿主防御多肽的作用，氨基酸序列为 GKIIKLKASLKLL-CONH2，其摩尔质量为 1424 g/mol、等电点为 10.4、平均亲水性为 0.1。
2.1.1 纯钛的预处理
1）将纯钛片剪成 10mm×10mm 规格、边缘工整的正方形；
2）浸泡于丙酮 12h，先用环己烷超声清洗 2 次，每次 30 min,再浸泡于去离子水超声清洗数次直至水清，自然烘干；
3) 将剪裁清洗好的钛片浸泡于 0.2 g/ml 的 NaO H 中，放置于 60°C 的恒温箱中过夜；
4) 隔天取出用流动去离子水冲洗，并浸泡于去离子水中两次，每次 30min，自然烘干后保存于真空干燥箱中。
材料清洁处理原理：丙酮清洗纯钛样本表面的杂质，环己烷可溶解丙酮，超声去离子水进一步清洗洁净。高温状态下浸泡于强碱溶液中可在纯钛表面形成一层疏松的富含羟基的非晶态钛凝胶层结构。
2.1.2 预处理后硅烷化涂层
1) 将预处理后表面有疏松结构的钛片浸泡于由 7ml 无水戊烷+1.2ml 95% 3-氯丙基三乙氧基硅烷+0.6ml 二异丙基乙胺均匀混合后溶液中 1h；
2) 取出钛片后用流动去离子水冲洗两次，自然烘干并保存于真空干燥仪中。硅烷化涂层原理：乙氧基的水解作用可与钛表面的羟基产生缩聚反应，形成Ti-O-Si 结构，有助于下一步抗菌肽的结合。
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2.2 不同处理组钛片电化学腐蚀性能的研究
2.2.1 物相结构
1)磨平、抛光：同前；
2）清洗、灭菌、烘干：同前；
3）X 射线衍射仪分析：将试件夹持后置于 X 射线衍射仪的载物台上进行晶体结构检查。参数设置为衍射角（2θ）扫描角度为 30-95°，扫描速度为 0.5°/s,靶材为 Co-Kα,加速电压为 40kV,灯丝电流为 30mA,石墨弯晶单色器滤波。
4）统计分析：通过软件 Jade 6.5 并且比对 PDF 卡片对试件进行物相分析，利用绘图软件 OriginPro 8.0 绘制 XRD 谱图。
2.2.2 电化学腐蚀
金属和电解质组成两个电极，组成腐蚀原电池。工作原理如下图：
临床医学参考
2）电极及电解液准备：准备辅助、参比电极和电解液，安装电解池；设置铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极夹持试件，中性人工唾液（pH=6.8±0.2）作为电解液；根据 ISO-10271-2020 建立反应体系，其中参比电极装入鲁金毛细管中，管尖端与测试面保持 2mm 距离；设置恒温磁力搅拌机的搅拌温度为 37℃、搅拌速度为 120 转/分。
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3 结果....................25
3.1 电化学腐蚀................25
3.1.1 XRD 分析..............25
3.1.2 EIS 检测..............25
讨论.......................30
结论....................30
讨论
根据骨免疫理论，种植体植入体内后若可以引导骨免疫反应向有利于骨再生的方向发展，则说明该植体具有良好促骨生成特性，远期种植成功率高,种植术后预后良好。在本研究中，通过硅烷化涂层界面将抗菌肽GL13K固定于纯钛表面，使纯钛表面形成多孔结构，其粗糙度适当增加，具有良好的机械稳定性和更好的耐电化学腐蚀性。这一新的抗菌肽涂层已被证明具一定的促进成骨分化和成血管分化作用。
本研究采用硅烷化涂层的方式固定抗菌肽 GL13K，即只在纯钛表面添加了有机涂层和生物活性蛋白，而没有将表面与其他金属离子融合，旨在维持纯钛表面结构的稳定性。为进一步明确该涂层方式是否会在纯钛表面氧化层引起结构上的改变，本研究通过 XRD 检测对不同组的钛表面结构进行检测，而如图 3.1 XRD 检测的结果所示，硅烷化涂层和 GL13K 涂层均没有引起纯钛内部结构的显著变化，满足钛表面改性对内部结构稳定性的要求。
本研究前期研究结果表明，GL13K 涂层钛具有较强的抗菌性、良好的细胞相容性和较少的炎症反应。钛材料的耐电化学腐蚀性与其机械稳定性、金属离子释放和生物相容性密切相关，是考量种植体材料是否符合临床应用要求的主要因素之一，可作为预测口腔临床应用中种植体稳定性和后期骨整合成功率的第一步。
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结论
在本研究中，抗菌肽GL13K涂层钛在改性后仍维持内部结构稳定性，具有良好的耐电化学腐蚀性性能。GL13K涂层可引导巨噬细胞向有利于骨组织再生的方向发展，亦表现出促进BMSCs晚期成骨分化的作用，如COL-1α1表达上调和细胞外基质矿化增加，而在成骨分化早期阶段则没有明显变化，因为ALP和RUNX2的表达量没有显著性差异。此外，抗菌肽GL13K涂层钛表面对HUVECs成血管分化起到显著促进作用，促血管生成关键基因(ICAM-1、angs 、KDR 和VEGF-A)的表达上调就证明了这一点。综上，本研究以抗菌肽GL13K涂层钛为基础、巨噬细胞RAW264.7为切入点，研究抗菌肽GL13K涂层钛表面对巨噬细胞极化状态的影响及其作用机制，相关因子对成骨、成血管分化的影响，以免疫调节细胞对组织再生的影响为出发点，以期能在种植体植入体内后减少炎症反应，并加快骨组织再生，为未来的种植体设计提供一种新思路。
参考文献（略）