前 言
骨质疏松症（osteoporosis ）是一种在 衰老人群中 最高发的退 行性疾病（degenerative disease）之一。骨质疏松性骨折是一个全球性健康问题，在骨质疏松症患者中，有将近一半的人曾发生过脆性骨折（fragility fracture），骨折一旦发生，其再次骨折的几率也将大大提高，给家庭及社会打来巨大的经济和精神负担。因此，在骨质疏松发生的早期阶段就采取医疗干预手段对于预防严重的骨量丧失和骨质疏松性骨折是必要的。然而，骨质疏松是一种隐匿性骨骼疾病（silent skeleton disease），它的发生通常没有明显的或特异性的症状。所以，临床上急需一种兼具灵敏性、特异性和方便性的骨质疏松诊断技术。目前，基于双能 X 线扫描术（dual energy X-ray absorptiometry，DXA）的骨密度检测是骨质疏松诊断的金标准（gold standard）。尽管双能 X 线扫描检查在临床上使用较为广泛，但较高的价格、不可移动性以及潜在的辐射危险都限制了其在大规模筛查和传统体格检查中的应用。血清中的生物标志物（biomarkers）对于疾病的诊断具有重要作用。目前，血清骨转换标志物（bone turnover markers，BTMs）常作为评价骨代谢水平的有效指标。但是，传统的骨转换标志物在骨质疏松的诊断方面并不能体现出较高的灵敏性（sensitivity）和特异性（specificity）。
近年来，一种稳定存在于体液（body fluid）中的 microRNA——循环 microRNA 成为了分子诊断领域的焦点，多项研究表明，循环 microRNA 具有作为分子诊断标志物的巨大潜力。循环 microRNA 能够在生理条件下稳定表达，在离体条件下也能够稳定存在较长时间。大量研究表明，特异性的循环 microRNA 表达的异常与疾病的发生与发展具有高度的相关性。目前，循环microRNA 作为分子标志物，已在肿瘤（tumor）、糖尿病（diabetes）、心血管疾病（cardiovascular diseases）、肺病（lung diseases）、肝病（liver diseases）等疾病中表现出了较好的诊断效能（diagnostic performance）。此外，一些研究显示循环 microRNA的表达在骨质疏松和其它骨骼疾病中发生异常，但是，尚无针对循环 microRNA 诊断骨质疏松症的大样本量三阶段病例-对照研究（case-control study）。因此，本研究希望通过两两独立的三阶段大样本量病例-对照研究来探索循环microRNA 在骨质疏松诊断中的作用及应用价值，并与传统骨转换标志物进行比较，为临床应用提供参考。
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正 文
第一部分 基于生物样本库的骨质疏松症相关的流行病学研究
骨质疏松症（osteoporosis）是一种以骨骼强度（bone strength）降低为主要特征的退变性骨骼疾病（skeleton disease）。骨骼强度主要决定于骨密度（bone mineraldensity，BMD）和骨质量（bone quality），其中，骨密度对维持骨骼强度的贡献约占70%，而骨质量对维持骨骼强度的贡献约占 30%，因此骨密度检查是目前较为公认的骨质疏松诊断金标准（gold standard）和骨折风险评估（fracture risk estimation）的重要指标。骨质疏松症为隐匿性疾病，在骨密度检查前或出现并发症之前通常不易被发现。骨质疏松症的主要并发症为脆性骨折（fragility fracture），即在较小的外力或者无外力作用下发生的骨折。骨折一旦发生，将给个人、家庭及社会造成巨大的医疗、经济及精神负担。所以，骨质疏松的预防、诊断及治疗对于防止骨折的发生至关重要。然而，目前我国民众对骨质疏松的认识尚不全面，致使骨质疏松的诊疗面临着巨大困难。流行病学（epidemology）调查是揭示我国骨质疏松症的发病现状的有效手段，对于诊疗指南的规划、民众相关医疗知识的普及是必要的。流行病学研究能够提供骨质疏松症的宏观数据，而近年来活跃于生物医学领域的生物样本库（biobank）则能够为揭示骨质疏松症的微观数据（包括基因组学、蛋白质组学、分子诊断学、治疗学等）提供保障。美国国立卫生研究院（United States National Institutes of Health，NIH）已资助多个美国本土的研究所建立生物样本库，并预言生物样本库是改变世界的十大新概念之一。因此，基于骨质疏松症的生物样本库的建立对于骨质疏松症的基础研究及临床转化（clinical translation）具有重要意义。本部分实验旨在建立以骨质疏松症为目标疾病、以第四军医大学附属医院为中心的血清样本库，为骨质疏松症的血清学研究提供保障。此外，对样本库中涵盖的生物样本进行流行病学分析，为骨质疏松的防治提供参考。
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1 实验材料
1.1 主要实验试剂与材料
碘伏消毒液（瑞泰奇科技有限公司，中国）75%酒精（瑞泰奇科技有限公司，中国）无菌棉签（威高科技有限公司，中国）头皮针（威高科技有限公司，中国）无菌真空干燥管（威高科技有限公司，中国）1.5 mL 无 RNA 酶无菌 EP 管（Eppendorf 公司，德国）1 mL 无 RNA 酶无菌枪头（Eppendorf 公司，德国）志愿者知情同意书（根据伦理委员会要求制定）志愿者信息采集表表（根据伦理委员会要求制定）样本库管理计划书（自制）
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2 病史采集
由 1 名经过培训的、具有 3 年以上临床经验的医师跟志愿者介绍本研究的背景、内容及研究方案，对志愿者的疑问进行解答，在自愿的前提下，指导志愿者阅读、签署知情同意书（informed consent）。采集并记录志愿者的个人史、病史、用药史及家族史，根据纳入标准和排除标准，初步筛选志愿者。由 3 名经过培训的、具有 3 年以上临床经验的医师、技师对志愿者进行健康检查。包括：一般体格检查、血常规检查、肝脏功能检查、肾脏功能检查、胸部 CT 检查、腹部 B 超检查。根据纳入标准和排除标准，进一步筛选志愿者。
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3 结果 ........62
3.1 训练阶段（training cohort）所用样本的人口统计学分析 ..........62
3.2 内参基因的筛选结果 ..............64
3.3 样本量估算结果 .....65
3.4 各 microRNA 的检测及诊断效能的评价 ......66
3.5 联合诊断模型的建立及诊断效能的评价 ......69
3.6 传统血清骨转换标志物诊断效能的评价 ......73
3.7 传统血清骨转换标志物及联合诊断模型诊断效能的比较 ..........74
3.8 单个 microRNA、传统血清骨转换标志物、联合诊断模型与骨密度的相关性分析 .......76
3.9 年龄、身高、体重、BMI 对联合诊断模型 Index1、Index1+P+C 诊断骨质疏松的影响 .....77
3.10 联合诊断模型 Index1、Index1+P+C 在不同性别人群中诊断效能的评价..........78
3.11 单个血清骨转换标志物、联合诊断模型 P+C、Index1、Index1+P+C ..........81
4 讨论 ........83
第五部分 循环 microRNA 预警骨质疏松及监测骨质疏松疗效的探索性研究
在第二、第三和第四部分的研究中，我们通过三个独立的阶段筛选出用于诊断骨质疏松症的若干候选循环 microRNA，并建立了联合诊断模型。基于目前的结果，我们可以得出循环 microRNA能够作为诊断骨质疏松症分子生物学诊断标志物的结论。在临床各学科中，与传统的病理学、影像学检测相比，分子生物学诊断的优势之一就是灵敏度较高，即当疾病开始阶段或发展阶段，组织或器官尚未发生病理学或影像学改变时，分子诊断标志物就能够较早的发生改变并被检测到。分子生物学标志物的这一特性决定了其在疾病预警及治疗效果检测中的地位。除了诊断与治疗，在临床中骨质疏松的防治仍面临两个重大问题，其一是如何预测骨质疏松的发生，其二是如何监测骨质疏松的治疗效果。虽然骨密度检测是骨质疏松诊断的金标准，但骨密度变化滞后于骨代谢的变化，因此无法起到预警骨质疏松及疗效监测的作用。此外，传统骨转换标志物虽然可以反映骨代谢的变化，但其特异性和灵敏性不佳，且容易受到其它因素的干扰，所以也无法成为理想的骨质疏松预警及疗效监测的标志物。基于循环 microRNA 对骨质疏松较好的诊断效果，我们试图进一步探索其在骨质疏松预警及疗效监测方面的作用。本部分实验为基于动物模型的补充研究阶段，该阶段承担的任务主要包括三项：第一，利用小动物模型（衰老性骨质疏松模型、雌激素缺乏性骨质疏松模型）验证循环 microRNA 对骨质疏松的诊断效能。第二，通过在衰老骨质疏松模型中设定年龄梯度、雌激素缺乏性骨质疏松模型中设定雌激素缺乏时间梯度，探索循环microRNA 在骨质疏松发展不同阶段的变化趋势，为循环 microRNA 在骨质疏松预警方面提供研究基础。第三，利用细胞治疗模型探索在细胞治疗前后骨质疏松动物体内循环 microRNA 的变化，为循环 microRNA 在骨质疏松疗效监测方面提供研究基础。这三项任务的完成将为循环 microRNA 作为骨质疏松预警分子、骨质疏松疗效监测分子提供数据支撑。
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小 结
本课题为一项大样本容量的临床研究。首先，通过对生物样本库临床资料的分析，初步探索西安地区骨质疏松症的流行病学特征，并明确了入库样本的临床代表性，为后续的研究提供了基本保障。其次，Discovery cohort 阶段，我们通过高通量microRNA 芯片对骨量正常、骨量降低和骨质疏松三者的血清 microRNA 表达谱进行了分析，筛选出了若干在这三者中渐变性、差异性表达的循环 microRNA。第三，Training cohort 阶段，我们利用 288 例样本对 microRNA 芯片结果进行了体外验证，进一步筛选出 10 个差异性表达的 microRNA；最终通过统计学处理纳入了 5 个microRNA 并建立了基于 Logistic regression 方程的联合诊断模型；通过与传统骨转换标志物的比较，突显了基于循环 microRNA 的诊断模型的优势。第四，Vlidation cohort阶段，我们利用独立于前两阶段的 160 例样本对 Training cohort 阶段的结果进行了进一步验证，明确了基于循环 microRNA 的骨质疏松诊断模型的真实性和有效性。第五，我们通过衰老性骨质疏松模型、雌激素素缺乏性骨质疏松模型以及细胞治疗模型这三种动物模型，初步探索了循环 microRNA 在骨质疏松的预警及疗效监测方面的作用。以上的序列研究为骨质疏松提出了新的分子生物学诊断学策略。本研究的主要发现与结论如下所示：⑴ 我们建立的生物样本库所纳入的样本具有临床代表性。⑵ 骨量正常、骨量降低和骨质疏松三类人群的血清 microRNA 表达谱存在差异。⑶ 单个循环 microRNA 可以诊断骨质疏松，但诊断效能较弱。⑷ 基于Logistic regression方程建立的联合诊断模型Index1对骨质疏松的诊断效能明显优于单个 microRNA。⑸ 联合诊断模型 Index1 对骨质疏松的诊断效能优于传统骨转换标志物。⑹ 传统骨转换标志物的纳入不能有效提升联合诊断模型对骨质疏松的诊断效能。⑺ 循环 microRNA 具有预警骨质疏松和监测骨质疏松疗效的潜力。
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参考文献（略）