前 言
各种原因如创伤、骨病等所造成的关节软骨面缺损引起的关节疼痛是骨科常见疾病。由于软骨组织无血管、淋巴管和神经组织分布，本身缺乏未分化细胞，并且软骨细胞包埋于致密的胶原－蛋白多糖基质中，限制其增值和迁移等原因，软骨自身修复能力有限，损伤后常导致关节功能障碍[1]。目前修复关节软骨损伤的方法主要有刺激关节软骨自身修复的方法和组织细胞移植法，包括软骨下钻孔术、微骨折术、骨膜或软骨膜移植术、骨软骨移植术以及软骨细胞移植术等[2-4]，但是这些方法都不能恢复关节软骨原有的结构和功能，因此关节软骨损伤的治疗仍是临床上急待解决的问题。组织工程的兴起为解决这一问题提供了新思路，使软骨缺损后再生成为可能。自1987 年Vacanti 等提出组织工程的概念以来，由于关节软骨损伤在临床上的常见性和治疗上的迫切性，以及软骨组成结构上的相对单一性，促使软骨组织工程迅速发展。目前支架研究的方向之一是将上述几种现有材料交联配合使用，相互弥补不足，以提高支架的理化及机械性能[17-19]。壳聚糖有良好的生物相容性，能够促进骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）等具有成软骨潜能细胞的分化，但其降解产物呈酸性，植入体内可能引起局部炎症反应；明胶是胶原的衍生物，具有细胞膜整合素结合区天冬氨酸－甘氨酸 -精氨酸- 苏氨酸序列和天冬氨酸-谷氨酸－甘氨酸-丙氨酸序列，具有特异性分子识别，可引导细胞的黏附，对细胞的生长、分化、迁移具有促进作用。
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第一部分 PHBV 复合生物玻璃制备 PHBV/BG 支架
材料和方法
高糖 DMEM 培养液（Gibco 公司，美国）、磷酸盐缓冲液(PBS)（Sigma 公司，美国）、Percoll 原液(Sigma 公司，美国）、Ham／F12 培养基(Sigma 公司，美国)、胎牛血清(FBS，HYCLONE 公司,美国)、L-谷胺酰胺(Sigma 公司，美国)、维生素C(Sigma 公司，美国)、青霉素(Sigma 公司，美国)、链霉素(Sigma 公司，美国)、非必需氨基酸(Sigma 公司，美国)、0．25％胰蛋白酶-0．2％EDTA(Sigma 公司，美国)、4％乙酸溶液(Sigma 公司，美国)、胶原酶(Sigma 公司，美国)、细胞滤器（100μm，BD 公司，美国）、谷氨酰胺(Sigma 公司，美国)、β-甘油磷酸钠(Sigma 公司，美国)、维生素 C(Sigma 公司，美国)、胰岛素(Sigma 公司，美国)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Sigma 公司，美国)、地塞米松(dexamethasone，Sigma 公司，美国)、吲哚美锌(Indomethacin zinc，Sigma 公司，美国)、转化生长因子（TGF- 1，RD公司，美国)、胰岛素样生长因子（IGF-1，RD 公司，美国)。
结 果
如图 1，2 所示，PHBV 和 PHBV/20%BG 支架材料呈三维多孔样结构，孔隙互相联通，两种支架孔隙大小为 200-300μm。PHBV 与生物玻璃复合后，材料的水接触角显著下降，且生物玻璃含量增加，水接触角减小，PHBV、PHBV/BG(10%wt)、PHBV/BG(20%wt)三者水接触角之间相比，差异均有统计学意义（P<0.05），即材料的亲水性得到明显改善（表 1）。如 3 图所示，PHBV、PHBV/10%BG、PHBV/20%BG 三者的孔隙率都在 80％左右，三者之间没有统计学差异（P>0.05）。即生物玻璃与 PHBV 复合后对 PHBV 支架的孔隙率没有显著影响。
第三部分 骨髓间充质干细胞的诱导分化及与软骨细胞隔离共培养........................ 45
材料和方法......................................... 45
结 果 ..........................................53
第四部分 PHBV/BG 支架复合 BMSCs 修复兔关节软骨缺损................................... 71
材料和方法.................................... 71
结果 .................................... 75
全文结论............................ 89
第四部分 PHBV/BG 支架复合 BMSCs 修复兔关节软骨缺损
材料和方法
动物模型手术器械；手摇钻及钻头；腰穿针；台式离心机（德国 Eppendorf 公司，5417R）；CO2细胞培养箱（Hereus BB5060 公司，Germany）；倒置显微镜及照相系统（OlymPus 公司，Japan）；超净工作台（苏州净化设备有限公司，中国）；6 孔、24孔组织培养板、50 ml 细胞培养瓶（Corning 公司，Germany）； -40℃，-20℃冰箱 （海尔公司，中国）；恒温水浴箱（新康医疗器械有限公司，中国）；Q-PCR 试剂盒与琼脂糖凝胶（Takara 公司，日本）；PCR 热循环仪（Biometra 公司，德国）；美国;FAC-Scan流式细胞仪（Backmen 公司，美国）。每组分别收集 5 个修复组织，根据 GenBank 公布的兔Ⅱ型胶原，采用 Primier3.0设计引物序列，由上海生工公司合成引物，引物序列见第三部分表 1。参考 Trizol 说明书，用 Trizol 试剂处理两组 ADSCs，提取细胞总 RNA。取 500 ng 用于逆转录，取逆转录得到的 cDNA 采用 PCR 试剂盒建立反应体系，将各反应管放入荧光定量 PCR仪，按下列条件扩增：95℃、5 min；95℃、15 s，60℃、60s，45 个循环。融解分析产物特异性，电泳鉴定产物大小正确。以 GAPDH 作为内参，用 LightCyclerSoftwareVersion 4.0 软件分析目的基因相对表达量。
结 果
实验中采用环锯在兔关节软骨面制作直径 5mm，深度 3mm 的软骨缺损（图 1），A 组实验组，关节软骨缺损处植入 BMSCs-PHBV/20%BG 复合物；B 组对照组，软骨缺损处植入单纯 PHBV/20%BG 支架；C 组为空白对照组, 软骨缺损未植入任何材料。16 周后取材行大体观（图 2）及软骨缺损修复处横截面（图 3）观察，实验组关节内无粘连，无滑膜炎表现，关节软骨缺损区有连续新生软骨样组织填充，缺损被修复的透明软骨组织完全覆盖，颜色、质地与正常表面周围关节面一致，缺损部位与周围软骨组织分界不明显（图 2a、图 3a）；对照组 16 周后软骨缺损区被纤维结缔组织填充，关节面缺损未被修复；空白对照组软骨缺损被大量纤维结缔组织形成，软骨缺损没有修复（图 2b、图 3b）。
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全文结论
1 生物玻璃和 PHBV 复合能够明显改善 PHBV 的亲水性，提高复合材料的力学强度；
2 生物玻璃和 PHBV 复合能够促进软骨细胞在支架材料上的粘附、增殖以及在三维多孔支架上的迁徙和均匀分布；
3 PHBV/生物玻璃复合材料具有多孔的三维结构和良好的生物相容性，与单纯PHBV 材料相比，PHBV/生物玻璃复合材料能够提高组织工程化软骨的质量，更适宜作为软骨组织工程支架材料；
4 软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。
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参考文献（略）