第一章 绪论
随着EC广泛的使用，其致癌性也很快被发现。1943年，Nettleship等发现EC 可以导致小鼠细胞癌变和肿瘤的形成[6]。在这之后，EC 的致癌性在许多模式动物中(大鼠、小鼠、仓鼠和猴子等)都得到了证明。基于这些实验结果，EC被认为是一种对人有潜在致癌性的物质，并在 1974年被国际癌症研究机构(IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现 EC 也可以直接诱发人的肝癌[7]，进一步促使 IARC 在 2007 年将 EC 的致癌等级由2B级提升到了2A级(与甲醛同级)。目前，EC只能被用作科学研究。对大多数人来说，酒精饮料和发酵食品是日常生活中最容易接触 EC 的方式。但由于EC检测技术的限制，直到 1976年，才由Ough首次报道了酒精饮品中的EC含量[8]。随着分析技术的发展和改进，许多酒精饮料和发酵食品中低含量的 EC 也逐渐被检测出来。近些年来，研究人员对世界各地多种酒精饮品进行了EC含量的检测(表1-1)。检测结果显示，EC 在大多数啤酒和麦芽饮料中检测不出或者含量极低；在高酒精度的白兰地中平均含量为 1073×10-9 g•L-1；而在黄酒(清酒)和葡萄酒中，EC 的平均含量分别为20-300×10-9 g/L 和 7-12×10-9 g•L-1[9]。
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第二章 酿酒酵母N85菌株尿素积累机理
2.1 前言
本章首先考察酿酒酵母 N85 菌株在人工合成的复合氮源培养基中对各种氮源的利用情况，找出N85 菌株较为偏好的几种氮源；再结合以往文献，分别检测这几种氮源对N85 菌株尿素利用的影响，从中选择对 N85 菌株尿素利用抑制作用最为明显的氮源；利用定量PCR技术寻找N85菌株尿素利用抑制过程中起关键作用的调控途径和调控因子；在这些实验结果的基础上，提出偏好型氮源对尿素代谢抑制作用的机理；并运用绿色荧光蛋白融合表达技术，研究偏好型氮源对寻找到的调控因子胞内定位的影响，验证抑制机理的正确性。
2.2 材料与方法
20 种常见氨基酸、硫酸铵、氨苄青霉素、蛋白酶 K、溶菌酶、YNB 合成培养基(无氨基酸和硫酸铵)、质粒小量提取试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；酵母基因组提取试剂盒、总 RNA提取试剂盒均购自Qiagen公司；DNA Marker、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、LA Taq HS DNA 聚合酶、大肠杆菌感受态制备试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、RNA反转录试剂盒 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、定量PCR试剂盒SYBR? Premix Ex Taq? II (Perfect Real Time)购自 TaKaRa 公司；酵母转化试剂盒Fast?-Yeast Transformation 购自 G-Biosciences 公司。酵母细胞在YPD培养中，30℃ (200 r•min-1)活化 20 h 后，转接至 YNB 培养基中(分别添加特异性检测氮源)，30℃ (200 r•min-1)继续培养 10 h。离心收集酵母菌体，立即置于液氮中研磨，并用酵母总 RNA 提取试剂盒获得酵母总 RNA。随后由 RNA 反转录试剂盒制备 cDNA。以所得酵母 cDNA 为模板，设计引物进行 qRT-PCR(见表 2-4)。实验以ACT1基因为内参基因，基因表达变化的计算采用2-??CT的方法[116]。表达变化量2倍以上的基因才被认为发生了显著的变化。
第三章 酿酒酵母氮代谢GATA 调控因子的胞内定位 ............................ 32
3.1 前言 .................. 32
3.2 材料与方法 ..................... 33
3.3 结果与讨论 .................... 35
第四章 代谢改造NCR调控因子降低酿酒酵母模式菌株尿素积累 .................. 41
4.1 前言 ..................... 41
4.2 材料与方法 ................................41
第五章 代谢改造尿素代谢调控途径降低酿酒酵母模式菌株尿素积累 .............49
5.1 前言 ...................... 49
5.2 材料与方法 .................... 50
5.3 结果与讨论 ...................................52
第六章 代谢工程改造酿酒酵母 N85菌株降低黄酒模拟体系中的EC 含量
6.1 前言
在第四章和第五章中，尝试了多种提高菌株尿素代谢能力的改造策略。其中虽然有少数策略的效果不明显(如磷酸酶的表达)，但大多数策略都可以有效降低模式菌株发酵过程中的尿素积累量。因此，这些策略(包括 Gln3p 和 Gat1p 的改造、Dal81p 和 Dal82p的过量表达等)都有应用于酿酒酵母 N85 生产菌株代谢改造的潜力。不过由于酿酒酵母菌株差异的原因，模式菌株中适用的改造策略，在以黄酒生产为目的的N85 菌株中是否可行是本章所需解决的关键问题。在本章的研究中，从酿酒酵母 N85 二倍体生产菌株出发，首先分离得到了 N85 单倍体菌株，并进一步添加了可供代谢改造的遗传标记；再以此为基础上，从前两章的改造策略中选择了效果较好的几种改造策略进行了尝试，并从中筛选出效果最好的一种方法；最后对改造后基因工程菌株的发酵特性进行了检测，以保证代谢工程的改造不会对 N85 菌株的生产特性造成显著的影响。
6.2 材料与方法
从产孢子培养基上挑取少量已形成子囊孢子的菌落，用无菌生理盐水稀释成浓度为107-108个/mL细胞的菌悬液。向菌悬液中加入0.3 g•L-1的蜗牛酶，30℃处理10 min去除细胞的子囊壁。取少许酶解后的菌悬液，涂布于 YPD 平板的一侧，使用显微操作仪仔细的将子囊破裂后释放出的四个孢子依次挑出至平板的另一侧(图 6-1)。将 YPD 平板于30℃培养2-4 d，待单孢子细胞形成菌落后，按文献的方法[142]对拆分出来的菌株进行倍型的检测。经检测确认后，将拆分得到的N85 单倍体菌株保藏，用于接下来的实验。
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主要结论与展望
（1）在 Gln3p 和 Gat1p 核定位研究基础上，尝试采用不同的策略进行了一系列的代谢改造(磷酸化位点的定点突变、核定位调控序列的缺失等)。实验结果表明，这些策略都可以在一定程度上缓解，而复合使用这些策略能获得最佳的改造效果。除此之外，进一步尝试来增强代谢改造的效果。实验结果表明，虽然敲除Ure2p对增强Gln3p和Gat1p活性的效果显著，会造成强烈的抑制作用，此策略无法应用于生产菌株的代谢改造中。
（2）尝试通过对尿素代谢相关调控途径的代谢改造，降低模式菌株发酵过程中的尿素积累量。实验结果表明，去磷酸化调控作用的效果有限；而强化的激活作用可以增强菌株尿素代谢的能力。此外，对Dal81p上的泛素化位点进行了定点突变。
通过本论文对酿酒酵母氮代谢阻遏效应的研究，发现了一些参与尿素代谢抑制的调控途径和关键调控因子。但由于酿酒酵母氮代谢调控网络复杂，还有许多未知的调控途径和调控因子有待发现。因此，在后续的研究中，可以用过基因组学、转录组学等高通量测序技术，对酿酒酵母的氮代谢网络进行全面的分析，获得更多、更精确的代谢调控模型。
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参考文献（略）