第一章 文献综述
1.1 拟南芥的研究价值
在形态学上拟南芥具有典型的十字花科特点（图 1-1），植株高度约 20~25 cm，主茎抽薹后可分生侧茎，叶片分基部莲座叶及茎生叶，叶片长 1.5~5 cm，宽 2~10 mm，边缘有锯齿，表面着生细毛。总状花序，花径约 3 mm，雌雄同花，自花授粉。果实为 20mm 左右长角果，每个果荚含 20~30 粒种子，单株可产种子千粒。直根系，主根上着生小侧根。拟南芥具有多个野生生态型，如 Col，Ler，Van，Bay，C24，Ws，Cvi 等（Qinet al. 2012）。拟南芥可在培养箱、人工气候室、温室以及户外生长。春化有利于种子萌发，种子可直接播种于栽培基质或 MS 培养基，需水肥量适中。其最佳的生长条件为日温 23~25℃，夜温 18~20℃，相对湿度 50%，光照 130~150 μmol•m-2•s-1。生长 3 周后进入开花期，完成生育期需 6~8 周。植物学家开始研究拟南芥可追溯到 19 世纪末至 20 世纪初。F. Laibach 首次总结了拟南芥作为模式植物在遗传学研究上的潜在价值。大约在 1945 年，E. Reinholz.第一次系统的收集了拟南芥突变体。20 世纪 50 年代，Langridge 等人开展了一系列实验室工作，奠定了拟南芥作为研究对象的基础。1960 年，第一届拟南芥国际研讨会召开。1975 年，Rédei 发表了经典的拟南芥研究综述。1983 年，第一张拟南芥精细遗传图谱绘制完成，奠定了其作为作为分子遗传学研究模式植物的地位。1990 年，拟南芥基因组计划发起。1993 年建立了农杆菌介导的高效遗传转化系统。2000 年底全基因组测序完成（Arabidopsis Genome Initiative 2000），2005 年 TAIR（The arabidopsis informationresources）发布了最新版本的拟南芥基因组数据。从此，拟南芥的研究进入了全面功能基因组时代，研究成果如雨后春笋般出现，并在今后相当长一段时间内延续。
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1.2 植物的免疫系统
植物生长在开放的自然环境中，为了抵御病原微生物侵害，它们在长期的进化中形成了一套有别于动物的免疫系统。动物免疫系统依赖于专属化的细胞、器官及发达的循环系统。植物则没有特异分化的免疫细胞，免疫反应由基因、蛋白、植物激素如茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和水杨酸（Salicylic acid，SA）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、microRNA 等参与完成。植物的防御反应包括，气孔的关闭、胼胝质的沉积、活性氧的迸发、抗病相关基因的表达（如病程相关基因，Pathogenesis-related gene，PR gene）、水杨酸的累积、细胞程序化死亡（Programmed cell death，PCD）等。植物防御病原入侵的第一道物理屏障是由表皮的蜡质、细毛等构成，此外植物还有角质层屏障、分泌抗菌活性物质及水解酶等防御系统，此种抗病机制称为非寄主抗性（Non-host resistance）。但病原菌还可通过其他途径克服第一道屏障，如细菌通过气孔、伤口等到达植物细胞，真菌可通过菌丝直接到达植物细胞，此时植物的第二道屏障，如细胞壁发挥作用，当病原菌克服细胞壁到达细胞膜时，植物则启动自身先天免疫反应展开与病原菌的对抗（此时植物被视为该病原菌的寄主）。植物先天免疫的激活及其一系列下游免疫反应，即就是我们讨论的植物免疫系统。植物的先天免疫反应分为两个阶段，初始阶段的 PAMP 激活免疫（PAMP triggered immunity，PTI）和随后的 Effector 激活免疫（Effector triggeredimmunity，ETI）。PAMP（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP）是病原菌产生的多肽蛋白类分子。
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第二章 MUSE5/TXR1/AtPAM16 的图位克隆及功能研究
2.1 试验材料
1. 拟南芥野生型：Col（带有 pPR2::GUS 报告基因），Ler；
2. 拟南芥突变体（Col 为遗传背景）：snc1，mos4 snc1，txr1-1（Wolf-Rudiger Scheible教授赠），bir1-1（张跃林教授赠），T-DNA 插入突变体 SALK_061634C（订购于拟南芥生物资源中心 ABRC）；
3. 用于转基因的载体：pCAMBIA1305，p425-GPD；
4. 用于遗传转化的菌种：大肠杆菌 DH10B，农杆菌 GV3103；
5. 酵母突变系：pam16-1（Peter Rehling 教授赠）；
6. 用于感染试验的病原菌：H.a. Noco2（Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2，一种卵菌，用于检验 Col 基础抗性），P.s.m. ES4326（Pseudomonas syringae pv. maculicolaES4326，一种细菌，用于检验基础抗性）；
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2.2 试验方法
2.2.1 muse 突变体遗传筛选
除特别说明外，所有的植物材料都生长在温室内（22℃，光周期 16 h 光照/8 h 黑暗）。用浓度为的 20 mM 的 EMS 处理 mos4 snc1 双突变体种子约 10000 粒，处理时间 18 h。播种约 50000 粒 M2 代种子，筛选类似 snc1 形态的植株。对候选植株进行 GUS 染色检测 PR2 的表达，能显示 GUS 蓝色的植株进行 H.a. Noco2 接种试验以检验抗病性，muse5为筛选得到的其中一个突变体。
2.2.2 基因表达分析
分析抗病报告基因 PR-1 和 PR-2 的表达。拟南芥种子播种于 1/2 MS 培养基，待植株 2 周大小后，收集 0.07 g 植物组织用于提取总 RNA（Ambion 生产的总 RNA 提取试剂盒），将 0.4 μg 的总 RNA 反转录为 cDNA（Invitrogen 公司生产的 Superscript II 反转录试剂盒）用于 real-time PCR 的模板。PCR 反应程式为：94℃ 2 min，94℃ 20 s，58℃30 s，68℃ 1 min，30 个循环。所使用的荧光染料来自 QuantiFAST SYBR Green PCR 试剂盒。以 ACTIN 作为内参，3 次重复。最终结果来自于 3 次独立试验重复。用于基因表达分析的引物序列如下：PR-1-F：5’-GTAGGTGCTCTTGTTCTTCCC-3’PR-1-R：5’-CACATAATTCCCACGAGGATC-3’PR-2-F：5’-GCTTCCTTCTTCAACCACACAGC-3’PR-2-R：5’-CGTTGATGTACCGGAATCTGAC-3’ACTIN-1-F：5’-CGATGAAGCTCAATCCAAACGA-3’ACTIN-1-R：5’-CAGAGTCGAGCACAATACCG-3’
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第三章 MUSE10 的图位克隆及初步功能研究........38
3.1 试验材料 ......... 38
3.2 试验方法 ......... 38
3.3 试验结果 ......... 41
3.4 讨论 ....... 47
第四章 番茄及其他植物中 Pam18 和 Pam16 同源蛋白分析......48
4.1 材料与方法 .......... 48
4.2 试验结果 ......... 50
4.3 讨论 ....... 60
第五章 番茄 PHD 锌指基因家族及蛋白分析.....62
5.1 材料与方法 .......... 63
5.2 试验结果 ......... 64
5.3 讨论 ....... 73
第五章 番茄 PHD 锌指基因家族及蛋白分析
番茄（Solanum lycopersicum）是一种全球范围内广泛栽培和消费的蔬菜，也是浆果类作物的模式植物。番茄的遗传特性和基因组序列较为清楚，是基因组相对较小（~900Mb，n =12）的二倍体植物（The Tomato Genome Consortium 2012），有大量高精度的分子标记，丰富的种质和突变体资源库，遗传转化也相对容易（Matsukura et al. 2008）。番茄的遗传和功能基因组学研究将大大促进其他茄科植物的研究。目前，在番茄上越来越多重要基因的功能得到揭示（Martin et al. 1993; Powell et al. 2012）。但是，仍然有许多基因功能未知，尤其是那些决定重要农艺性状的基因。为了研究基因的功能，首先需要挑选候选基因，可通过生物信息学方法先对某一基因家族进行分析，然后从中挑选研究对象是较为可行的方法。PHD 锌指蛋白家族最早由 Schindler 等人于 1993 年在拟南芥中发现，被命名为 HAT3蛋白，含有典型的 Cys4-His-Cys3 保守基序（Schindler et al. 1993）。PHD 锌指结构域大约包含 50 到 80 个氨基酸，可以结合两个锌离子形成两个环状结构，不同的 PHD 锌指蛋白组成环状结构的氨基酸有所不同，决定了它们功能特异性。一般来将，PHD 锌指结构域由一个双链 β 折叠和一个 α 螺旋组成的球状结构，在真核生物中，这种结构和结合锌离子的 Cys4-His-Cys3 基序是高度保守的。PHD 锌指结构域可以单独或成串出现，也会和其他结构域相连。一般认为 PHD 锌指蛋白家族定位于核蛋白（Sanchez et al. 2011），与表观遗传、组蛋白修饰以及染色质介导的转录调控有关（Aasland et al. 1995）。一些研究表明PHD锌指结构域及其相关LIM和RING结构域可能与蛋白对蛋白、蛋白对DNA、蛋白对 RNA 互作相关（Lyngso et al. 2000; Linder et al. 2000）。也有研究表明 PHD 锌指结构域具有 E3 泛素链激酶活性（Aravind et al. 2003; Coscoy et al. 2003）。在植物中，关于 PHD 锌指蛋白的研究已有一些报道，例如拟南芥 PHD 锌指蛋白 ALFIN-LIKE 6 在缺磷胁迫下与根系生长有关（Chandrika et al. 2013）。水稻 PTC1 编码 PHD 锌指蛋白与细胞凋亡和花粉管发育有关（Li et al. 2011）。大豆 GmZF-HD1 和 GmZF-HD2 在应对病原侵染时起转录因子的作用调控 GmCaM4 的表达（Park et al. 2007）。
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结 论
1、通过正向遗传学方法，我们筛选到拟南芥 muse 突变体，进而鉴定出若干未知的负向调控 NB-LRR 类 R 蛋白介导免疫的基因，MUSE5 是鉴定出的负调控基因之一。通过图位克隆，MUSE5 为 At3g59280。研究发现，MUSE5 编码的蛋白和酵母线粒体内膜转运蛋白亚基 PAM16 同源，定位于拟南芥线粒体内膜（融合蛋白 AtPam16-GFP 也定位于线粒体内膜），所以将 MUSE5 更名为 AtPAM16。在拟南芥中，AtPAM16 与另一个蛋白 AtPAM16L 同源。双突变体 Atpam16-1 Atpam16l 是致死的，说明 AtPAM16 对拟南芥存活必要性。单突变体 Atpam16 植株矮小，表现出对病原菌的抗性并累积活性氧 ROS，根据 AtPAM16 定位于线粒体的结果，推测 AtPAM16 参与了线粒体内膜转运机制，该机制负向调控免疫反应，抑制了自免疫，保护植物免受 ROS 伤害。
2、拟南芥 muse10 是我们筛选出的另一个突变体，通过图位克隆，最终将 MUSE10定位到染色体的某个唯一候选基因，随后进行了 Allelism test 验证。muse10-1 的突变位点在该基因的第 677 个碱基（由 G 突变成了 A），导致蛋白产物的第 226 个氨基酸由半胱氨酸成了酪氨酸。MUSE10 编码 PHD 锌指类蛋白。进一步分析 muse10 单突变体，在形态上 muse10-1 增强了 snc1 的表型，在抗病上，由于基因冗余，单突变体 muse10-1 不具有抗病性，但双突变体 muse10-2 snc1 和 snc1 抗病水平相当，且形态上比 snc1 更小。综合来看，muse10-1 在形态和抗病上均增强了 snc1 介导的免疫反应，所以野生型MUSE10 应该是 snc1 介导的免疫反应负调控因子。此结论揭示了拟南芥基因 MUSE10新的功能（负调控 R 蛋白免疫），丰富了人们对 MUSE10 的认识。
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参考文献（略）