本文是一篇临床医学论文，本研究创新性的建立4T系统。恒温提取核酸，与传统核酸提取方法的高温要求相比，仪器配置要求低，操作简便；恒温扩增序列，TSA法基于PCR原理，在37℃即可扩增目标序列，与现有qPCR方法相比，保持高灵敏度和特异性的同时，温控要求低，气溶胶交叉污染风险低，时间更快；
第1章 引言
1.1 新型冠状病毒概述
自2019年12月起，由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2）感染引起的急性呼吸道传染病，在全球各地广泛传播，被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）命名为新型冠状病毒肺炎（Corona virus disease 2019，COVID-19），我国简称新冠肺炎[1-3]。SARS-CoV-2是一种单股正链包膜RNA病毒，属于冠状病毒科β型冠状病毒属，是继人冠状病毒229E（HCoV-229E）、人冠状病毒香港1（HCoV-HKU1）、人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）、人冠状病毒NL63（HCoVNL63）、急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）之后被发现的第7种可感染人类的冠状病毒[3-5]。SARS-CoV-2基因组全长约29.9 kb，具有多个开放阅读框（Open reading framework，ORF），其中ORF1a/b编码16种非结构蛋白，其余ORF编码结构蛋白和辅助蛋白[6]。冠状病毒的四种重要的结构蛋白为：刺突糖蛋白（Spike protein，S）、小包膜蛋白（Envelope protein，E）、囊膜蛋白（Membrane，M）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）[7]。新冠病毒主要通过呼吸道飞沫传播，病毒包膜上的S蛋白通过与宿主细胞中的血管紧张素酶Ⅱ（ACE2）结合，可感染多个器官，病毒大量复制并影响机体的正常功能[8]。新冠病毒感染人体后造成COVID-19，患者会出现发热、干咳、鼻塞、喉咙痛、头痛、肌痛、乏力和腹泻等症状，重症者可出现急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、心脏损伤、脓毒症休克、获得性出凝血功能障碍、多器官功能衰竭等并发症严重危害生命[9,10]。虽然新冠肺炎的死亡率相较于重症急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）更低，但新冠肺炎具有更快的传播速度[11]。自发现第一例新冠肺炎患者起，短时间内新冠疫情在世界各地迅速蔓延，造成了全球大流行[12-15]。截至北京时间2022年11月，新冠疫情已波及全球200多个国家和地区，全球累积确诊病例超过6.3亿，死亡人数超过650万（https://www.worldometers.info/coronavirus/）[16]。全世界感染人数和死亡人数急剧上升，已经严重危害人类的生命健康，对全球公共卫生和社会稳定造成巨大威胁[17]。
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1.2 CRISPR-Cas概述
成簇规律性间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）与相关序列（CRISPR-associated sequences，Cas）一起构成CRISPR-Cas系统，是古细菌和细菌获得适应性免疫，应对抵抗入侵的病毒和质粒的防御机制[25]。CRISPR序列由重复序列（Repeats）和间隔序列（Spacers）间隔排列而成，重复序列含有回文序列，可以形成发夹结构[26]。而间隔序列多来源于入侵的外源DNA，当外源的病毒和质粒DNA侵入带有CRISPR-Cas系统的细菌或古生菌时，通常会将外源的一小段DNA序列插入到CRISPR 5’端两个重复序列之间，形成一个新的间隔序列。来自外源DNA的序列信息储存在重复序列之间，然后作为免疫记忆，在这些外源DNA再次入侵时，CRISPR序列经过转录、切割并加工为成熟的crRNA，crRNA引导Cas蛋白识别、切割与之同源的侵入性核酸，这一自适应免疫的过程可概括为适应、表达和干扰三个阶段[25,27]。
CRISPR-Cas系统基于Cas蛋白组成和效应复合体之间的差异被分为两个类别，包括六种类型和四十八个子类型，第一类包含I型、III型和IV型系统，是由多个Cas蛋白效应器和crRNA组成的复合物。第二类包含II型、V型和VI型系统，是单Cas蛋白效应器和crRNA组成的复合物[28,29]。II型是目前研究最广泛的系统，包含代表性的Cas9[30]。在V型系统中Cas12是其典型的Cas蛋白[31,32]。而VI型系统是现阶段最新的CRISPR-Cas系统，包括4个子类型，其中Cas13是其标志性蛋白[33]。II型、V型和VI型系统具有不同检测原理，但它们均有cr RNA介导的核酸内切酶活性，其中II型、V型靶标是DNA，VI型系统靶标为RNA[34]。此外，Cas12和Cas13除对靶标进行切割外，同时对侧枝非靶标DNA或RNA进行裂解，这种具有反式切割活性的Cas蛋白在核酸检测的发展中显示着巨大的潜能[31,35,36]。
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第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 样本来源
本研究中使用的呼吸道感染病原体包括新冠病毒（SARS-CoV-2 N基因，GenBank 登录号LC528233.1），对照病毒SARS冠状病毒（GenBank 登录号NC_004718.3），流感病毒A型（GenBank 登录号NC_007362.1），流感病毒B型（GenBank 登录号NC_002205），流感病毒C型（NC_006306）；SARS-CoV-2假病毒购自圣翊生物（中国深圳），对照病毒质粒均由金斯瑞（南京，中国）合成；27例SARS-CoV-2临床样本来自南昌大学第一附属医院，所有临床样本均获得患者同意。
2.1.2 主要试剂
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2.2 实验方法
2.2.1 引物、crRNA和报告基因设计
已发表的SARS-CoV-2 N 基因从GenBank获得，并通过Primer Premier 5进行比对以找到保守区域。设计了3对特异性引物和三个特异性crRNA，使用前在NCBI中使用 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）确认引物的特异性。较长的片段用于构建质粒，较短的引物长度为30 bp用于RT-TSA扩增，20 nt crRNA片段用于Cas12的荧光检测。ssDNA-report分别在其5’和3’末端标记有FAM-BHQ1，FAM-Bio。引物、crRNA、ssDNA-report由生工生物（中国上海）合成；这些寡核苷酸的详细信息显示在表2.3。
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第3章 结果.............................................. 10
3.1 4Ts平台建立 ...................................... 10
3.2 引物和crRNA筛选 ..............................11
3.3 横向侧流试纸条检测结果 .............................. 11
3.4 基于 4Ts系统的装置设计 ................................ 12
第4章 讨论............................ 17
第5章 结论........................................... 21
第4章 讨论
自COVID-19疫情发生以来，短时间内已蔓延到世界各地，迅速发展为全球大流行病[15]。COVID-19的出现严重威胁人类的生命健康，给卫生服务及全球医疗机构带来了巨大压力。COVID-19疫情常态化防控期间，能够快速、准确和早期筛查出COVID-19是有效预防疫情进一步扩散的关键[18]。目前，COVID-19的常规诊断手段有分子检测、血清学检测和计算机断层扫描（CT）[2]，其中RT-PCR被认为是COVID-19确诊的金标准，已广泛用于COVID-19的早期筛查和临床诊断，但RT-PCR需要在医疗机构进行且需要配备专业人员及设备，在资源稀缺的偏远地区难以进行，同时该方法耗时较长，难以满足现场核酸快速检测的要求[18]。因此，探索一款灵敏、高效、操作简捷且不依赖于昂贵设备的检测方法用于COVID-19的筛查和诊断非常重要。
针对现场检测工具，世界卫生组织（WHO）制定了“ASSURED”标准：负担得起（Affordable）、高灵敏度（Sensitive）、高特异性（Specific）、用户友好（User-friendly）、快速稳健（Rapid and robust）、无需大型设备（Equipment）、可交付给最终用户（Deliverable to end user）[45]。出于这一目的，基于CRISPR-Cas的核酸检测技术因其快速、简单、灵敏、准确、低成本等优点在病原微生物的检测方面具有非常大的应用前景。CRISPR-Cas系统能够准确识别和切割特定的DNA或RNA序列，已被用于基因编辑技术，同时也被证明是一种强大且准确的诊断工具[46]。特别是Cas12和Cas13在识别靶标序列后，被激活的Cas蛋白可切割反应体系中的任意DNA或RNA序列，利用这一特性可实现对体外核酸的特异性检测[32,47]。据报道，Huang等[48]基于RT-RAA与CRISPR-Cas12a技术开发了一种快速核酸检测平台，通过葡萄糖生成反应实现信号的转导，从而将靶标的浓度信号转换为葡萄糖的信号，最终利用家用血糖仪读取检测结果，该方法可对SARS-CoV-2 N基因进行定量检测，检测范围在101-104拷贝/微升，具有低成本、检测时间短、不需要专业仪器等优点，为疫情防控的早期诊断提供便携有效的工具。Gootenberg等[49]基于Cas13a和RPA等温扩增技术开发了一种核酸检测平台（Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK），其检测灵敏度达到阿摩尔级，可鉴别单个碱基差异，能快速准确地检测寨卡病毒、登革热病毒以及癌基因DNA的突变。
临床医学论文参考
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第5章 结论
（1）基于RT-TSA和CRISPR-Cas12a的核酸检测体系，创新性建立4T系统，实现新冠病毒N基因快速、简便、高灵敏、高特异的核酸检测，为临床检测新冠病毒提供一种新方法。
（2）探索一种检测新冠病毒的便携式使用装置，按操作流程能便捷、快速检测新冠病毒存在，具有重要的经济和社会价值。
参考文献（略）