实验一 槲皮素对牙本质酸蚀性磨损影响的原位研究
1.1 材料
藻酸盐（Heraeus Kulzer，Germany）； 超硬石膏（Heraeus Kulzer，Germany）； 自凝牙托粉（上海医疗器械股份有限公司，中国）； 牙托水（上海医疗器械股份有限公司，中国）； 槲皮素（Sigma-Aldrich，USA）； 氟化钠（分析纯，索莱宝，中国）； 柠檬酸（分析纯，索莱宝，中国）； 可口可乐（重庆可口可乐饮料有限公司，中国）； 人工唾液（广州誉扬仪器有限公司，中国）； 砂纸（320~1200 目，勇士，中国）； 慢速锯片（TC-501-F，Buehler，USA）； 颌垫膜片（Ultradent，USA）； 有孔不锈钢托盘（福州市万齐医疗器械有限公司，中国）； 牙膏（Colgate® Cavity Protection，Colgate-Palmolive Company，USA）； 牙刷（Colgate® Plus，Colgate-Palmolive Company，USA）； 慢速硬组织切割机（Isomet，USA）； 体视显微镜（Stemi2000-C，Zeiss，Germany）； 表面轮廓仪（SEF 680，Kosaka Laboratory，Japan）； 超声清洗机（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司，中国）； 真空压膜机（Ultradent，USA）； 电子天平（MP6001，上海恒平科学仪器有限公司，中国）
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1.2 方法
本项目的研究方案经过福建医科大学附属口腔医院生物医学研究伦理委员会批准（批准号：[2019]福医口伦理审字第（46）号）。
1.2.1 志愿者招募
使用 G.Power 软件（Version 3.1.9.2，Windows，Dusseldorf，Germany）计算本研究所需样本量。采用单因素方差分析，当效应量（effect size）为 0.5、alpha值（α）为 0.05、统计检验力（power）为 0.8、自由度为 5、组数为 6 时，每个亚组所需样本量至少为 10。每个颌垫式牙托包含 4 个试件，因此共需招募 15 名志愿者。招募条件如下：口腔卫生良好，牙面酸蚀及磨损程度为 0~1 级；无活动性龋病、牙周炎，且没有全身系统疾病、怀孕、或者哺乳、使用固定或者可移动的正畸装置；半年内无较规律服用致口干性药物史[10,50]。所有参与试验的志愿者均在实验前进行常规牙周洁治并签署知情同意书。
1.2.2 颌垫式牙托制备
1.2.2.1 离体牙的收集
收集来自福建医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊因阻生或滞留等无法保留的完整第三磨牙，去除附着在表面的软组织、牙结石、菌斑、色素等，生理盐水 4℃冰箱中保存。收集的离体牙均来自 25±5 岁的汉族青年，均签署拔牙知情同意书。
1.2.2.2 试件的制备
使用慢速硬组织切割机在流水冷却下，冠根分离，去除冠方及四周牙釉质，暴露冠部牙本质，在体式显微镜的辅助下，将牙本质表面有裂痕、缺陷、脱矿、龋坏的牙齿丢弃，制备长宽厚度约为 2 mm×2 mm×2 mm 的牙本质标准块。采用硅橡胶模具将牙本质包埋于自凝型义齿基托树脂中，形成圆台体形实验样本块，上表面直径约为 3 mm，下表面直径约为 4 mm，高 2.2 mm[10]。在制备过程中，将远髓面暴露于圆台体上底面正中央。将试件表面依次用 320、600、1200 目的耐水砂纸逐一磨平抛光。冲洗干净后，试件置于超声清洗机荡洗 2 min，用 0.1%溴麝香草酚浸泡 7 d。试件表面两侧用牙科小棉签涂布两层指甲油作为基准面，以阻挡酸蚀作用，在中间留出宽 1 mm 的区域不涂布，作为酸蚀面[51]。
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实验二 槲皮素的稳定性、黏附性能及渗透深度研究
2.1 材料
槲皮素（Sigma-Aldrich，USA）； 无水乙醇（分析纯，汕头市西陇化工有限公司，中国）； NaOH（分析纯，上海宝瑞化工有限公司，中国）； HCl（分析纯，上海宝瑞化工有限公司，中国）； 磷酸二氢钠（分析纯，上海宝瑞化工有限公司，中国）； 砂纸（320~1200 目，勇士，中国）； 慢速锯片（TC-501-F，Buehler，USA）； 紫外-可见光分光光度计（Q5000，北京鼎国昌盛生物技术有限公司，美国）； 激光显微共焦拉曼光谱仪（Invia Reflex，RenishawE，UK）； 电子分析天平（MP6001，上海恒平科学仪器有限公司，中国）； 高速离心机（Thermo，Fisher，USA）； 纯水机（PURELAB Classic DI/UV/UF/UVF，ELGA Lab Water，United Kingdom）； pH 计（PHS-25，上海雷磁仪器厂，中国）;
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2.2 方法
2.2.1 影响槲皮素稳定性的因素研究
2.2.1.1 pH 对槲皮素稳定性的影响
（1）实验分组：槲皮素-乙醇原液、pH=3 的槲皮素-乙醇溶液、pH=5 的槲皮素-乙醇溶液、pH=7.4 的槲皮素-乙醇溶液、pH=8 的槲皮素-乙醇溶液、pH=10 的槲皮素-乙醇溶液。
（2）标准溶液的制备：配制 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液以及 0.5 mol/L 盐酸溶液。称取 30 mg 槲皮素 6 份，分别置于 100 ml 容量瓶，无水乙醇充分溶解后，其中 5 份使用 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液、0.5 mol/L 盐酸溶液分别调节 pH 至 3、5、7.4、8、10，无水乙醇定容，磷酸盐缓冲溶液维持 pH 的稳定。其余一份作为槲皮素-乙醇原液不调节 pH 直接定容。
（3）不同 pH 的槲皮素-乙醇稳定性评价 以无水乙醇作为参照溶液对 UV-Vis 进行调零，对槲皮素-乙醇原液以及不同pH 的槲皮素-乙醇溶液分别在配制后进行 200~500 nm 波长范围的光谱扫描，扫描间隔 1 nm。测定三次取平均值绘制光谱曲线。比较槲皮素-乙醇原液以及不同pH 的槲皮素-乙醇溶液的光谱图，分析各组分子结构的变化。
2.2.1.2 保存时间对槲皮素稳定性的影响
选取 2.2.1 中，pH 稳定性较佳的槲皮素-乙醇溶液，分别于 0、4、8、24、48、72 h，进行 200~500 nm 波长范围的光谱扫描，扫描间隔 1 nm。测定三次取平均值绘制光谱曲线。分析不同 pH 的槲皮素-乙醇溶液随时间变化的稳定性。
临床医学论文参考
实验三 槲皮素影响牙本质酸蚀性磨损的机制研究.........................41
3.1 材料.........................41
3.2 方法.............................................42
3.3 结果................................47
全文总结.............................54
实验三 槲皮素提高牙本质抗酸蚀磨损性能的机制研究
3.1 材料
明胶酶/胶原酶检测试剂盒（Thermo Fisher，USA）； MMP-8（Sigma-Aldrich，USA）； 胶原酶（Type IV，溶组织梭菌）； 槲皮素（Sigma-Aldrich，USA）； 氯己定（分析纯，索莱宝,中国）； 柠檬酸（分析纯，索莱宝，中国）； 1，10-菲啰啉（Thermo Fisher，USA）； EDTA（国药集团化学试剂有限公司，中国）； 黑色 96 孔板（比克曼生物有限公司，中国）； 微量加样器（Eppendorf，Germany）； 多功能酶标仪（Thermo Fisher，USA）； 荧光抗衰减剂（H-1200，Vector，USA）； 激光共聚焦显微镜（LSM 780，Carl Zeiss，Germany）； 恒温水浴箱（DK -8D，上海精宏实验设备有限公司，中国）； 分析天平（MP6001，上海恒平科学仪器有限公司，中国）； RCSB PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）； PubChem 化合物数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；OpenBabel version 2.4.1（www.openbabel.org）； AutoDock 4.2（Scripps Research，CA）； PyMOL 软件（DeLano Scientific LLC，USA）； 氰基丙烯酸盐粘合剂（Zappit，Dental Vestures of America，USA）； 微拉伸测试仪（T-61010K，Bisco，USA）；
临床医学论文怎么写
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全文总结
本研究采用原位酸蚀模型探讨了槲皮素对牙本质抗酸蚀磨损性能的影响，借助表面轮廓仪分析其应用效果。在此基础上，本研究针对两个问题进行深入研究：（1）槲皮素在复杂的口腔微环境中，尤其是在牙酸蚀症进展过程中的酸性微环境中是否能保持稳定，槲皮素的稳定性是否与 pH 相关，保存时间又是否影响其稳定性？其是否能黏附于牙本质表面并渗透至牙本质表层下？（2）槲皮素提高牙本质抗酸蚀磨损性能的机制是什么？针对第一个问题，本研究借助 UV-Vis 分析其分子骨架及官能团，评估 pH 以及保存时间对槲皮素稳定性的影响。通过构建槲皮素浓度与吸光度的标准曲线以及标准方程式，借助 UV-Vis，评估 pH、浓度以及作用时间对槲皮素黏附性能的影响。通过选取槲皮素的特征峰，借助LCRS 检测槲皮素渗透至牙本质的深度。针对第二个问题，本研究借助荧光定量明确槲皮素对 MMP-8 的抑制活性，分子对接技术明确二者的结合模式与相互作用的机制；在此基础上，通过原位酶谱技术进一步验证槲皮素对牙本质源性MMPs 的抑制活性；通过测定牙本质胶原纤维的微拉伸强度，明确槲皮素对牙胶原纤维机械性能的影响。实验结论如下：
（1）75 μg/ml、150 μg/ml、300 μg/ml 的槲皮素均能显著提高牙本质抗酸蚀磨损性能，且效果随浓度递增。其中 150 μg/ml、300 μg/ml 的槲皮素效果显著高于 120 μg/ml 的氯己定 ，具有良好的临床应用潜能。
（2）槲皮素在中性（pH=7.4）及弱酸性（pH=5）条件下较为稳定，而在碱性条件下，槲皮素稳定性较差。槲皮素-乙醇原液、pH=5、7.4 的槲皮素-乙醇溶液随着时间延长，稳定性较佳，而 pH=3 的槲皮素-乙醇溶液则在 48 时降解速度加快。
（3）不同作用时间（1、2、4 min）和不同 pH（槲皮素-乙醇原液、pH=3、5、7.4 的槲皮素-乙醇溶液）对槲皮素的黏附性能影响甚微。300 μg/ml 槲皮素-乙醇原液作用于牙本质 4 min 后的渗透深度最大可达 30 μm。
（4）槲皮素与 MMP-8 的相互作用受活性位点残基氢键的影响，它们之间的相互作用主要包括与 Ala-161、Glu-198 及 Tyr-2168 残基形成的三重氢键相互作用，二者的结合能为-38.456 KJ/mol。
参考文献（略）