第一部分 富血小板纤维蛋白（PRF）的获取和结构特征
1 序言
富血小板纤维蛋白（PRF）被称为是继富血小板血浆（PRP）后的第二代的血小板浓缩液，它自身含有大量的细胞因子，例如众所周知的血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）等，在 PRF 的形成过程中通过自体血的 3000rpm 离心 10min，大量的纤维蛋白原交织成网状支架结构并很好的实现了对上述细胞因子的包裹。有报道指出，PRF 对这些因子的缓释作用可以达到 7-10 天之久。我们的实验快速从比格犬颈外静脉获取新鲜血液并立即放入离心机中，首先验证比格犬获得的富血小板纤维蛋白的结构特点，为后续的体外和体内实验做铺垫。
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2 材料与方法
2.1 主要试剂与仪器
2.1.1 主要试剂
戊二醛 上海金泓化工有限公司
4%多聚甲醛固定液 上海金泓化工有限公司
包埋剂 OCT 常州市飞勒斯仪器有限公司
苏木素 上海永叶生物科技有限公司
伊红 上海永叶生物科技有限公司
叔丁醇 上海乙基化工有限公司
2.1.2 主要实验器材及仪器
玻璃离心管 上海楚柏实验室设备有限公司
倒置相差显微镜 Leica，德国显微镜 Olympus，日本
10cm 细胞培养皿 Corning，美国
6 孔培养板 Corning，美国
低速型台式大容量离心机 上海
安亭科学仪器厂，上海
富血小板纤维蛋白制备装置 创音公司，上海
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2.2 实验方法
2.2.1 富血小板纤维蛋白的制备和获取
比格犬按 1mg/kg 的剂量，行 3%戊巴比妥麻醉后，颈部消毒，从颈部一侧搏动较强处的颈外静脉快速抽血 20ml 后平均放置于两个玻璃离心管中，3000rpm、10min的条件下在离心机中获取三层结构，上层为乏细胞层，下层为红细胞层，中间层即是我们需要的富血小板纤维蛋白结构，它比较容易从三层结构中分离出来，最后将获得的所有富血小板纤维蛋白凝胶统一放置于 PRF 盒中（创英公司）压膜备用。
2.2.2 富血小板纤维蛋白的结构观察
（1） 扫描电镜观察 PRF 结构
将获取的 PRF 放入 2.5% 的戊二醛溶液中浸润 1 小时，用 PBS 洗净后依次用浓度梯度为 50％、70％、80％、90％、100％的叔丁醇脱水，最后真空干燥仪干燥 24小时。采用金离子溅射法镀膜，扫描电镜(Vega, Tescan, Philadelphia, PA)观察并采集图像。
（2）PRF 冰冻切片行 HE 染色后观察结构
1.将获得的 PRF，放平摆好，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
2.将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平 。
3.调好欲切的厚度，为 5～10um 间，进行切片，并铺展于载玻片上。
4.切片固定 30 秒－1 分钟。
5.水洗。
6.染苏木素 3－5 分钟。
7.分化。
8.于碱水中返蓝 20 秒。
9.伊红染色 10－20 秒。
10.脱水，透明，中性树胶封固。
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3 讨论
从比格犬颈外静脉抽取的血液在及时离心的条件下可以获取我们需要的富血小板纤维蛋白，我们认为在 PRF 的制备过程中有几点需要掌握，首先获取的血液的速度要快，这相较于富血小板血浆的获取方式截然不同，并且血液量要足够；其次，取血后到放置在离心机的这个过程也要快速防止在离心前血液凝固，富血小板血浆在离心前加入了抗凝剂，而富血小板纤维蛋白不需添加任何辅助剂；最后在离心结束后不要急于将试管拿出，要静止 5 至 10 分钟可以让纤维蛋白更好更紧密的交织到一起。我们的 HE 染色和扫描电镜观察到获取的富血小板纤维蛋白具有大量的纤维蛋白丝交织成网状，其中包裹了大量的细胞因子以及白细胞，可以用来利用到后续实验中。
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3 结果............31
3.1 比格犬乳牙牙髓细胞、恒牙牙髓细胞的获得及培养.......31
3.2 两种细胞多向分化鉴定..............32
3.3 MTT 实验..........32
3.4 碱性磷酸酶半定量和钙结节半定量结果........33
3.5 RT-PCR 检测相关成骨基因........ 35
4 讨论............37
第四部分 富血小板纤维蛋白（PRF）对比格犬牙髓细胞的体外作用
1 序言
在构建组织工程骨的过程中，成骨细胞以及骨髓间充质干细胞已经被验证为最具效果的细胞，对于其他细胞来源，从人的智齿获得的恒牙牙髓细胞同时具有细胞的多重潜能；自 2003 年，Miura 等[18]首次发现从人脱落的乳牙中分离到的一种细胞，具有自我更新的能力、多分化潜能和免疫调节功能，并将该细胞命名为乳牙牙髓细胞。本实验采用改良组织块法获取比格犬乳牙牙髓细胞和恒牙牙髓细胞，并验证两种细胞的多向分化潜能。体外将富血小板纤维蛋白（PRF）作用于比格犬牙髓细胞，并评价其体外的相关成骨作用，为 PRF 构建组织工程骨提供更优越的种子细胞奠定一定的实验基础。乳牙牙髓的获取通过拔除 3~6 月龄幼年比格犬乳磨牙完成，恒牙牙髓细胞的获取通过拔除 12~15 月龄成年比格犬恒磨牙完成。拔出后的牙放置于含有双抗的DMEM 培养液的离心管中，之后用 75%酒精棉球仔细擦拭牙体，高速金刚砂车针沿牙体的颈部磨一圈直至透红，将牙齿移于超净台内沿磨出的深沟劈开牙冠，取出冠根部的牙髓。采用改良的组织块法[3]进行比格犬的乳牙牙髓细胞和恒牙牙髓细胞的原代培养。约 5~7 天后待有细胞爬出进行首次换液，之后每 3～4 天换液一次，待细胞扩增汇合至培养皿 80%～90%时，可以进行细胞传代。
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结论
（1）富血小板纤维蛋白是一种多孔的纤维网状支架结构，并对细胞无毒害作用。
（2）体外富血小板纤维蛋白作用于乳牙牙髓细胞、恒牙牙髓细胞以及骨髓间充质干细胞可以较明显的促进其增殖以及成骨分化。其中乳牙牙髓细胞的体外成骨作用更为明显，表现为对富血小板纤维蛋白更为敏感。
（3）富血小板纤维蛋白复合骨髓间充质干细胞构建组织工程骨相较于单纯的富血小板纤维蛋白和血凝块可以有效并且更早期的修复骨缺损。
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参考文献（略）