本文是一篇临床医学论文，本研究通过构建高糖细胞模型和糖尿病牙周炎大鼠模型研究了桑叶水体物对糖尿病牙周炎的影响。
第一部分：桑叶水提物对高糖环境下成骨细胞的作用研究
1研究内容
1.1 研究对象
新生小鼠颅顶骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 Subclone 14)是一种永生化细胞，常用于骨相关研究，购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0378。
1.2 主要试剂及耗材
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2 实验方法
2.1 MC3T3-E1细胞培养
2.1.1 MC3T3-E1细胞复苏
取出课题组前期冻存的MC3T3-E1细胞，快速放入恒温水浴锅中，保持冻存管的盖子在水面以上，使其快速解冻，避免发生污染。其解冻后立即取出，使用移液枪吸取细胞悬液至α-MEM的完全培养基中混匀，离心(1000rpm,5min)后。弃旧液，加入新的完全培养基重悬，后放入细胞培养瓶中，37℃的恒温培养箱中培养。
2.1.2 细胞换液
通常2-3天换液，还应根据细胞密度改变，更改换液时间。若培养基颜色发生改变，则应换液。先弃去原培养基，加入一定量的PBS缓冲液，至少盖住培养皿的底部，避免干燥，轻轻涮洗，重复2-3次。弃液，加入适量常温α-MEM 完全培养。
2.1.3 细胞传代
待MC3T3-E1细胞密度达到80%左右时可传代，传代前预热试剂，具体步骤为，先弃去旧培养基，放入适量PBS缓冲液清洗 (重复三次)，加入1.5mL的胰蛋白酶，摇匀后，放入恒温培养箱中消化细胞。待细胞开始皱缩，变圆且脱落后，在超净台中，加入2倍以上的完全培养基，暂停消化。使用移液枪轻轻吹打瓶底使细胞完全脱落,高速离心(1000rpm,5min)，弃去旧液，加入适量完全培养基，充分混匀后，按1:3的比例进行传代。
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第二部分：桑叶水提物对实验性糖尿病牙周炎大鼠的作用研究
1研究内容
1.1 实验对象
本实验所选用的动物购自于新疆医科大学动物实验中心。均为6-8周龄的雄性（Sprague-Dawley,SD)大鼠，饲养级别为无特定病原体(Specefic pathogen free,SPF)级别，体重在160g-180g。许可证号为：SCXK(新)2020-0002。实验操作符合相关要求，并且通过了新疆军区总医院实验动物福利伦理审查委员会的批准。(DWLL20230620)
1.2 主要实验仪器
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2 实验方法
2.1 溶液配制
2.1.1 桑叶水提物溶液的配制
称取5g的桑叶水提物粉末，加入生理盐水，定容到10mL，将其摇晃至完全溶解，即无明显的漂浮和块状物质，现配现用。
2.1.2 链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)溶液配制
取出1mg的链脲佐菌素粉末，放置于避光环境中，使用移液枪缓慢滴入1mL提前预冷的柠檬酸钠缓冲液，操作时尽可能轻柔避免将粉末吹起，随后将混合液吸移至含有9mL柠檬酸钠缓冲液的避光离心管中，充分摇匀，后将其放入避光的冰浴中待其完全溶解，尽可能在30min内使用。
2.2 实验分组及动物模型的构建
2.2.1 实验分组
将36只SD大鼠，按体重顺序编号，用随机数表法，将其随机分为6组，每组6只。按干预方式将其分为：对照组(Control Group,CG)：正常喂养，每日给予等量的生理盐水灌胃＋局部涂抹凝胶，不做任何其他干预。牙周炎模型组(Periodontitis Group,PG)：正常喂养，仅单纯结扎，每日给予等量的生理盐水灌胃＋局部涂抹凝胶，不给予其他干预。糖尿病牙周炎模型组(Diabetes Periodontitis,DP)：高糖高脂饮食喂养配合链脲佐菌素注射，待糖尿病模型构建成功后，继续牙周结扎，每日给予等量的生理盐水灌胃＋局部涂抹凝胶。给药剂量参考代等研究[32, 33]和预实验,实验组分别为:高浓度桑叶水提物组(High Concentration Sangye,SH): 高糖高脂饮食喂养配合链脲佐菌素注射，待糖尿病模型构建成功后，继续牙周结扎,同期给予8mg/kg的桑叶水提物每日灌胃处理＋局部涂抹含桑叶水提物的凝胶。中浓度桑叶水提物组(Medium Concentration Sangye,SM): 高糖高脂饮食喂养配合链脲佐菌素注射，待糖尿病模型构建成功后，继续牙周结扎,同期给予4mg/kg的桑叶水提物每日灌胃处理＋局部涂抹含桑叶水提物的凝胶。低浓度桑叶水提物组(Low Concentration Sangye,SL): 高糖高脂饮食喂养配合链脲佐菌素注射，待糖尿病模型构建成功后，继续牙周结扎,同期给予2mg/kg的桑叶水提物每日灌胃处理＋局部涂抹含桑叶水提物的凝胶。
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结果······················· 50
小结··················60
讨论·············61
讨论
1.桑叶水提物对高糖环境下成骨细胞的影响
研究发现，在一定浓度和时间范围内的高糖环境不仅可以抑制成骨细胞的增殖和成骨分化，还可以并且降低成骨标记物Col-1、OPG、ALP等的表达[39]。MC3T3-E1细胞常被用于在体外模拟成骨分化，是被大多数研究认可的体外成骨细胞模型[40]。因此，本实验将MC3T3-E1细胞放入不同浓度的高糖培养基中分别培养1天、3天、5天和7天，通过CCK8法检测 MC3T3-E1在高糖环境下的增殖情况，用以筛选出合适的糖浓度用以在体外构建高糖环境模拟糖尿病患者体内的高血糖。研究结果发现，40mM浓度范围内的葡萄糖在短时间内非但不会抑制MC3T3-E1细胞的增殖，甚至在一定程度上还会促进其增殖。可能是由于葡萄糖本身就是培养细胞所需的营养物质，小范围内增加其生长所需的营养反而促进了细胞的增殖。50mM浓度的葡萄糖从第3天开始，显著抑制了MC3T3-E1细胞的增殖，从形态学来看，50mM浓度的高糖环境会导致细胞发生轻微形变，高浓度的葡萄糖会导致细胞大范围的死亡。故本实验选用50mM的糖浓度用以构建体外高糖细胞模型，与欧[41]等结果一致。
桑叶作为我国传统中药材，含有酚类、生物碱类、多糖类、氨基酸类等多种活性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎和抗肿瘤等药理作用。桑叶主要包括黄酮、多糖和生物碱等202种活性成分，其中22种对糖尿病及其并发症的治疗具有显著疗效[42]。本课题组前期研究发现，桑叶水提物可以在正常及炎症环境中促进成骨细胞的增殖和分化。因此本实验选用不同浓度的桑叶水提物和高糖培养基联合培养MC3T3-E1细胞，通过CCK8法分别检测其在1天、3天、5天和7天的增殖情况筛选出适宜的桑叶水提物浓度用以接下来的实验。研究结果表明，10mg/mL的桑叶水提物有明显的细胞毒性，从第三天开始，1mg/mL-1ng/mL浓度的桑叶水提物均可以在一定程度上促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的增殖。其中100μg/mL、10g/mL、1g/mL浓度的桑叶水提物效果最佳，用以后续实验。
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3不足与展望
本研究初步探索了桑叶水体物对糖尿病牙周炎的影响，为桑叶水提物用于防治糖尿病牙周炎提供了一定的实验和理论依据。然而本研究也有一定的局限性。首先，骨改建是由成骨细胞和破骨细胞共同作用的复杂过程，但本实验只研究了成骨细胞，并没有研究破骨细胞，因此在后续的研究中还需进一步验证桑叶水提物对破骨细胞的影响，从而使研究结果更加完善。其次，本研究虽然证明了桑叶水提物对糖尿病牙周炎大鼠有良好的抗炎和成骨的效果，但由于国际上尚未出现被广泛认可的可用于同时治疗糖尿病和牙周炎的药物，所以本实验设计中没有设立阳性对照组，这使得我们无法直接比较本研究方法与已有治疗方法的优劣，因此在后续的研究中仍需进行更深入的研究，以便为其应用于临床治疗提供更多的实验和理论依据。
本研究通过构建高糖细胞模型和糖尿病牙周炎大鼠模型研究了桑叶水体物对糖尿病牙周炎的影响。研究结果表明桑叶水提物可以促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的增殖，具有良好的抗炎、抗氧化以及促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。桑叶水提物还对糖尿病牙周炎大鼠有良好的降糖和抗炎效果，并且可以促进牙槽骨的形成和减少骨质的吸收。综上所述，本研究证实了桑叶水提物在高糖环境下具有促进牙槽骨成骨的作用，是潜在的糖尿病牙周炎防治药物，为糖尿病牙周炎的临床诊疗提供了一种新思路。
参考文献（略）