第一篇 文献综述
第 1 章 华支睾吸虫和华支睾吸虫病
华支睾吸虫（Looss，1907 年）是后睾科（Opisthorchiidae）家族的一种常见的肝吸虫，这种肝吸虫广泛分布于东亚，并在一些地区重度流行[1]。虽然我国第一个感染华支睾吸虫的病例报道于 1878 年，但是湖北省考古证据表明，人类感染可以追溯到至少 2300 年前[2]。我国的几次大规模流行病学调查发现，这种疾病在更广泛的地理区域流行，覆盖全国 23 个省/自治区/直辖市，其他流行地区与中国接壤，如韩国、俄罗斯东部和越南[3]。由华支睾吸虫感染引起的疾病状态称为华支睾吸虫病。肝吸虫和人体之间能很好地适应彼此，大多数受感染的人类感觉主观症状较小，只有严重感染的病例，有上腹痛的并发症，大便稀溏，发热，食欲不振，和全身不适等；这就是肝吸虫能存活在人体中，被医生、卫生政策当局、甚至感染个人忽视的原因。然而，在流行地区华支睾吸虫病是当前危害健康主要问题，世界卫生组织将华支睾吸虫病列入被忽视的热带病的计划当中。此外，华支睾吸虫还可以引起人类胆管癌，有显著科学证据证明会发生严重并发症，因此它于 2009 年被国际癌症研究机构重新分类为 1类生物致癌物[4]。
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1.2 生物学和生活史
像大多数其他的复殖类吸虫，华支睾吸虫的成虫是一个背腹扁平、雌雄同体的两性吸虫，通常长 10-25mm，宽 3-5mm，带有前口吸盘，中央腹吸盘和子宫孔隙；华支睾吸虫的生活史牵涉终宿主哺乳动物人类，狗和猫等（有性繁殖），第一中间宿主淡水螺类（无性繁殖）和第二中间宿主淡水鱼虾（有性繁殖）[5,6]。淡水螺是第一中间宿主，淡水螺吃掉水中的华支睾吸虫虫卵，在其体内孵化成毛蚴，毛蚴成长为胞蚴，一个胞蚴发育成 20-50 个雷蚴，一个雷蚴产生约50 个尾蚴，最终 1000-2500 个尾蚴从受感染的螺中脱落到水中，尾蚴快速游动去寻找第二中间宿主[7]。在螺体内的幼体阶段只在夏季进行无性繁殖，在螺体内的幼虫发育时间为 95 天,许多鲤科鱼类是第二中间宿主，当尾蚴遇到第二中间宿主，它们便侵入鱼的皮肤粘膜并在肌肉中形成囊蚴，通过动物试验确定囊蚴的成熟需要 30-45 天[8]。囊蚴为球状，直径为 130-160μm，幼虫能在鱼肉中存活一年，直到来年夏天，当哺乳动物（包括人）摄取含囊蚴的鱼肉，鱼体内囊蚴到达十二指肠，在几分钟的时间内脱囊，并快速地迁移到胆道系统[9]。当幼虫到达肝内胆管，他们成长为成虫，成虫可在人体内存活 26 年以上[10]。一条成虫每天有性生殖产生的虫卵数约为 2500-3000 个[7]。虫卵随着胆汁到达小肠，再通过粪便排出体外，然后进入水中继续其生命周期。在终末宿主中，成虫主要生活在肝内胆管和胆囊，较少的存在于肝外和胰腺导管，每只成熟华支睾吸虫成虫能持续排卵 6 个月，根据哺乳动物宿主物种的不同每天产 1000-4000 个卵；芝麻形的卵，有卵盖，每个卵内包含一个完全成形的幼虫即毛蚴，卵被从成虫的子宫孔释放进入胆汁和小肠，随后，通过粪便排出到外部环境，最终到达淡水中；这些虫卵由一系列作为第一中间宿主淡水螺类摄入体内，毛蚴在淡水螺的胃肠道从卵中孵化出来，然后在肠壁或其他器官经无性繁殖转变成胞蚴（4 小时内），大约在 17 天内变为雷蚴，经过 21-30 天，发育为尾蚴。尾蚴有一条长长的尾巴，有长背鳍和一些较短的腹鳍，精细的脊骨皮层，7 对渗透腺体，14 个包囊形成的腺体，1 对眼斑和大量的褐色色素，感染性钉螺脱落后，运动型尾蚴进入水中，找寻第二中间宿主，通常是鲤科淡水鱼，尾蚴穿透鱼鳞片，并在皮下或肌肉组织中形成后期包囊蚴，这样尾蚴失去眼斑并发展成一种带有粗糙折光颗粒的网状排泄囊，囊蚴阶段通常是卵形（约 120×140μm），并拥有相对薄壁。成百上千的囊蚴可在单个鱼体内生存，根据物种和生态环境，因此被终宿主感染[5,11]。
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第 2 章 华支睾吸虫抗原抗体的研究进展
2.1 华支睾吸虫粗抗原的研究进展
主要包括囊蚴粗抗原、童虫粗抗原、成虫粗抗原等。
2.1.1 华支睾吸虫囊蚴粗抗原
首先把鱼肉进行消化，经过人工脱囊，脱囊后作为免疫抗原免疫动物收集血清，采用免疫荧光技术对产生的抗体进行虫体定位，幼虫的抗原虫体定位主要在排泄囊上， ELISA检测结果显示，阳性符合率最高为89.1%，与血吸虫交叉反应为3.6%[109，174]。
2.1.2 华支睾吸虫童虫粗抗原
对此方面研究相对较少，以华支睾吸虫囊蚴感染鼠或家犬，使用 12-19 日童虫抗原进行皮内实验来进行诊断研究，结果表明皮试试验反应的强弱与感染数量存在一定的关系[174]。
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2.2 华支睾吸虫基因重组抗原的研究进展
随着近年来分子生物学技术的快速发展和应用，华支睾吸虫基于这个技术的基因重组抗原的研究越来越多，华支睾吸虫重组抗原不仅为解决虫源问题提供一条便利的途径，而且可以根据实际诊断的需要进行修改以提高和改善抗原的敏感性和特异性，已经成为华支睾吸虫目前诊断方面研究的热点和焦点；目前获得华支睾吸虫特异性基因蛋白的方法有：一、利用已知基因设计特异性引物从虫体cDNA文库或mRNA文库中获取基因序列，二、对文库基因进行随机测序获得基因序列并进行克隆与表达，三、利用患有华支睾吸虫病病人的阳性血清或感染华支睾吸虫的动物血清对华支睾吸虫成虫cDNA表达文库进行免疫学筛选，进而获得基因序列并进行表达与克隆。谷胱甘肽转移酶（GSTs）是一组同工酶,它广泛的存在于各种生物体内，具有多个基因编码和多种功能，它可以解除毒性复合物的毒性，通过催化多种内源性和外源性毒素与谷胱甘肽反应的方式，在寄生虫能否在宿主体内生存与发育中起着举足轻重的作用；寄生虫体内的GSTs能中和免疫细胞中巨噬细胞和嗜酸性粒细胞产生的氧自由基，这些细胞在宿主与内源性毒性副产物的初次免疫应答中起着重要作用，它们或被动地结合于驱虫药上，例如阿苯达唑，或者是结合内源性疏水基，例如胆汁酸；所以GSTs被认为是在吸虫的存活过程中起着重要作用的多功能酶；在曼森血吸虫和肝片吸虫中，GSTs已经成为针对曼森血吸虫和肝片吸虫攻击性感染的保护性疫苗候选物，在对其虫体的免疫荧光定位中，GSTs在血吸虫和片形虫中被定位于被膜和软细胞组织上，并在降低自由基损害的细胞防卫中起到重要作用[114]。
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第 3章 华支睾吸虫重组蛋白 CsG1、CsG2....55
3.1 材料 ........55
3.2 方法 ........56
3.3 结果 ....58
3.4 讨论 .........66
3.5 小结 .........67
第 4章 华支睾吸虫虫卵的 PCR 方法鉴定.........68
4.1 材料 .........68
4.2 方法 .........69
4.3 结果 .........71
4.4 讨论 .........74
4.5 小结 .........75
第 5章 华支睾吸虫病 ELISA 诊断方法的建立.........76
5.1 材料 .........76
5.2 方法 .........77
5.3 结果 .........79
5.4 讨论 .........88
5.5 小结 .........90
第 5 章 华支睾吸虫病 ELISA 诊断方法的建立及免疫价值评价
目前 ELISA 法是一种可靠的诊断华支睾吸虫病的方法，它使用的是成虫的粗提物或排泄分泌（ES）产物，使用粗提物抗原的诊断敏感性为 87.8％，而使用 ES 抗原敏感性为 93.1％[140]。目前粗提取物抗原被用于常规的 ELISA 诊断，因为制备足够量的 ES抗原进行分析比较困难。华支睾吸虫的一些重组蛋白已被生产和鉴定，它们包括延伸因子-1α[143]，7-kDa 蛋白，28-半胱氨酸蛋白酶，和26-kDa 和 28-kDa 的谷胱甘肽 S-转移酶[144]，豆荚蛋白[145]，及 21.1-kDa 的体表蛋白[146]。大多数重组蛋白对肝吸虫病的血清学诊断都比较敏感和特异，但其特异性还不足以取代目前常用的粗提取物，这是需要进一步研究的课题。本章主要以三个重组蛋白 CsG1、CsG2 和 CsG6 作为诊断抗原，摸索最佳抗原工作浓度及血清稀释倍数，及其它最佳反应条件，建立重组蛋白的华支睾吸虫病 ELISA 诊断方法，并鉴定其敏感性和特异性，为试剂盒的研制及华支睾吸虫病的诊断提供理论依据和技术支持。
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结 论
1、成功构建了华支睾吸虫 3 个基因 CsG1、CsG2 和 CsG6 重组表达质粒pET-28a(+)-CsG1、pET-28a(+)-CsG2 和 pET-28a(+)-CsG6，并得到了高效表达；蛋白分子量分别约为 37 kDa、34 kDa 和 30 kDa；Western blot 分析表明重组蛋白可被感染华支睾吸虫人的阳性血清特异地识别。
2、成功制备了多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体 ELISA 检测抗体效价达到 1：204800，琼脂扩散效价达到 1:16；共筛选出 4 株特异性高的单克隆抗体细胞株，分别为 CsG1-3、CsG2-1、CsG6-2 和 CsG6-17，ELISA 效价均到达 1:6400，亚型分类分别为 IgG3、IgG2b、IgG2b 和 IgG2b。
3、多克隆抗体主要主要定位于口吸盘、腹吸盘，而单克隆抗体主要定位于口吸盘、腹吸盘、子宫内的虫卵及排泄孔中，为华支睾吸虫抗原的生物学功能及应用研究奠定了实验基础。
4、建立了华支睾吸虫虫卵的 PCR 鉴定方法，确定了人的阳性血清 210份。
5、建立了 3 种重组抗原的 ELISA 诊断方法，优化了 ELISA 检测方法的条件，对其敏感性与特异性进行了评价，其中以 CsG1 为最佳诊断抗原（敏感性为 100% (210/210)，特异性为 92.2% (59/64)，为 ELISA 诊断试剂盒及胶体金试纸条的研制打下了良好的理论依据和应用基础。
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参考文献（略）