本文是一篇工程硕士论文，本试验主要工作方法：首先，采用硫酸铵分级沉淀的方法从脱脂花生粉中提取并纯化Ara h 3，研究湿热处理对Ara h 3抗原性和蛋白结构的影响，并确定降低其抗原性的最优湿热处理条件；其次，用体外模拟消化试验评价Ara h 3在湿热处理后的消化稳定性变化；最后，建立针对Ara h 3的双抗体夹心ELISA检测方法，探讨含有Ara h 3的食物经湿热处理后抗原性变化。
1绪论
1.1食物过敏
1.1.1食物过敏简介
食物过敏是一种常见的免疫反应，它是由于个体摄入含有致敏蛋白的食物后，免疫系统对其中的蛋白质产生不适或过敏反应，导致免疫球蛋白E（Immunoglobulin E,IgE ）水平升高，从而引发的一种具有严重潜在生命危险的免疫反应[1]。轻则导致人体机能紊乱，组织损伤，出现瘙痒、呕吐、腹泻、荨麻疹、呼吸困难和低血压等症状，重则威胁生命健康[2]。
截止2016年4月，国际免疫学联合会（International Union of Immunological Societies,IUIS）和世界卫生组织（World Health Organization,WHO）认证并且命名的食物致敏原种类共计297种[3]。联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization,FAO）和世界卫生组织在1995年公布了生活中常见的8种重要致敏原食物[4]，它们分别是：大豆、鸡蛋、鱼类、坚果、小麦、牛奶、贝类和花生等，这些食物导致约90%以上的食物过敏反应[5]。
研究发现，食物过敏的病例越来越多，在全球约有10%的人口受其影响。据流行病学调查研究显示，全世界范围内大约有5%的儿童和1%~2%成人会对食物产生过敏反应，而且这一比例可能会持续上升[6]。据过敏性休克诱因的相关报道，在过去的10~15年时间里，2%~4%的人群食物过敏症状的发病是因为IgE介导所导致的，在婴幼儿群体中的发病率为5%~8%，而且还表现出显著增加的趋势[7]。近几十年以来，食物过敏性疾病的发生率在世界上的很多地方都有逐步上升的趋势，是儿童特别是婴幼儿常见的过敏性疾病之一[8]，食物过敏这种病理性免疫系统疾病已经成为一个非常严重的全球性健康问题。全人类的健康都受到过敏性疾病的严重影响，每个人都可能对不同的食物过敏，在生命中的各个年龄段都可能发生，过敏人群日常生活受到限制，并给医疗保健系统造成沉重负担。因此，人们对食物过敏的重视程度和警觉性也在逐年提高。
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1.2食物过敏危害
食物过敏反应的具体症状和体征有：头晕或意识丧失、皮肤瘙痒起皮疹、气道收缩、喉咙肿胀引起的呼吸困难等[13]。随着食物加工方法的不断变化，各个国家的食物品种越来越丰富，但其过敏症状的发生率也越来越高。西方国家是世界上食物过敏病例的高发国家，其中约为1%～3%的儿童对食物过敏反应的症状严重。食物过敏的患者，短时间内会表现出一系列恶心呕吐、气短或喘息、流鼻涕、口腔和喉咙周边发痒或刺痛等症状，这些症状会对心血管、皮肤、口腔和消化道等人体的各个器官造成极大的影响。与此同时，患者可能会出现荨麻疹、腹泻、哮喘等一系列临床症状，严重时表现为过敏性休克甚至威胁到患者生命[14]。
食物中的致敏原蛋白属于一类特殊的蛋白质超家族，分为Cupin超家族、醇溶蛋白超家族和植物防御蛋白家族[13]。作为八大食物过敏原之一，花生过敏与人类健康有着密切的相关性，在首次接触到花生时，花生过敏患者中70%~81%的患者就会出现过敏反应相应的症状。即使微量的花生也会引起与皮肤、胃肠道或呼吸道症状相关的严重过敏反应，对其高度敏感的人可能会死亡，而花生过敏症中有高达80%的比例是致命性或接近致命性，并且其发病率在呈现不断上升趋势[15]。
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2湿热处理对Ara h 3抗原性与结构影响
2.1前言
花生是生活中常见的食物和加工原料，因其含有大量的脂肪和蛋白质，而且花生蛋白质量好、价格便宜、来源广泛、组成特殊，具有洁白的颜色和较高含量的可溶性蛋白质[51]，无论是将其加入到动物性亦或是植物性食材原料中，都能起到改善品质、强化营养的效果[52]，因此，花生蛋白受到人们的青睐[53]。但花生作为八大类食物致敏原之一也令不少过敏人群望而却步[54]，推进生产加工低致敏性或无致敏性的含花生蛋白制品迫在眉睫。
花生球蛋白，是花生蛋白的主要成分，占花生总蛋白含量的63%左右，由三个分子量为35、39和42 kDa的酸性亚基和一个22 kDa的碱性亚基组成[55]，是花生蛋白的主要致敏原[56]。
本章选择花生蛋白主要致敏原花生球蛋白Ara h 3，就不同的温度和时间两种因素进行湿热处理，结合Xi等[57,58]的方法采用间接ELISA法对湿热处理后Ara h 3的抗原性进行检测，研究湿热处理对Ara h 3的分子量以及结构的影响，找出降低Ara h 3抗原性的最优湿热处理条件，以期为研发含Ara h 3低致敏性或无致敏性食物奠定基础。
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2.2仪器与材料
2.2.1试验仪器与设备
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参照杜寅[25]和尚阿晨[59]的方法以1:12的料液比向花生脱脂粉中加入0.01 mol/L的PBS缓冲溶液，高速匀浆10 min后，将溶液的pH调节至7.9，混合体系在50℃水浴振荡器中反应一段时间后，选取纱布对混合溶液进行过滤，得到滤液。使用离心机对滤液进行离心，在4000 r/min条件下进行10 min离心后弃去沉淀物，所得上清液即为总蛋白浸提液。在室温下向总蛋白浸提液中缓缓加入固体硫酸铵粉末（5~10 min加完，这一操作在磁力搅拌器上进行），使混合体系中的硫酸铵饱和度保持在40%左右[60]，在经过3 h的静置沉淀后，在8000 r/min条件下进行20 min离心，将沉淀物进行收集，将沉淀物转移到提前用乙醇煮沸处理过的透析袋中，用蒸馏水进行24 h的透析，将透析过程使用的蒸馏水进行4~5次的更换。将透析之后得到的沉淀物进行收集，并对沉淀物进行真空冻干，经冻干之后所得到的粉末即为试验所需要的Ara h 3
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3 体外模拟消化评估湿热处理对Ara h 3 消化稳定性影响 ............... 25
3.1 引言 .................................... 25
3.2 材料与仪器设备 ................................. 25
4 建立双抗体夹心 ELISA 法评价湿热处理后 Ara h 3 抗原性变化 ...................................... 33
4.1 引言 ................................................ 33
4.2 材料与仪器设备 ....................................... 34
结论 .............................. 48
4建立双抗体夹心ELISA法评价湿热处理后Ara h 3抗原性变化
4.1引言
食物中的致敏原蛋白的含量通常都是较低的，而且不同的致敏原蛋白之间可能会存在一定程度的交叉反应，这些原因使得食物中特定致敏原蛋白的检测困难程度增加。
有两类常用的检测方法可以用于食物中致敏原蛋白成分的测定：(1)应用于对致敏性基因残留量的聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）检测方法；(2)应用于对致敏原蛋白进行检测的ELISA酶联免疫吸附试验法、表面等离子共振法（SurfacePlasmon Resonance,SPR）、免疫印迹法（Western-blot,WB）[4]。
PCR表面等离子共振法是一种针对于检测致敏原蛋白DNA/RNA的技术。这一技术很早就被应用于检测致敏原，具有灵敏度高、特异性强等特点[84]。
SPR技术是一种新型的致敏原蛋白检测方法，它以生物芯片技术为基础，在芯片表面与需要分析样品进行结合，进而造成芯片折射率发生变化，而与芯片表面所结合的需要分析的样品的质量与折射率的变化成正比，根据这个原理即可构建出一种定量检测的方法[4]。
WB的优势在于其分析容量大、敏感度高、特异性强[85]。ELISA法是通过抗原与特异性抗体之间的反应来检测致敏原蛋白的一种方法。酶联免疫吸附试验的检测方法具有较快的检测速度、较高的检测灵敏度和较强的检测特异性[84]。ELISA法在近几年发展很快，主要特点在于能够对大批量的样品中的致敏原成分进行定性和定量分析，而双抗体夹心ELISA的检测限通常较低，且可以更有效的减少样品中存在的脂肪、纤维素、矿物质或其他蛋白质造成的基质效应。目前，该技术已被广泛应用于花生致敏原的检测。
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结论
1.采用硫酸铵分级沉淀法从脱脂花生粉中提取Ara h 3，提取纯化的Ara h 3经凝胶分析成像系统分析纯度达75%以上，满足试验所需要求。将提取纯化的Ara h 3进行湿热处理，研究湿热处理对Ara h 3结构和抗原性的影响。通过间接酶联免疫吸附的方法检测湿热处理后Ara h 3抗原性的变化：Ara h 3的抗原性在湿热处理后明显降低，且在90℃下进行30 min湿热处理时Ara h 3抗原性降到最低。对湿热处理后Ara h 3的结构分析：根据SDS-PAGE电泳图的结果可以判断出，100℃、30 min的湿热处理可以使Ara h 3解聚成小分子质量的蛋白条带，同时还会有大分子质量的蛋白质聚集体形成。可能是湿热处理打断了肽链之间相连的二硫键，改变了Ara h 3的分子量；由外源荧光图谱可知，湿热处理增加了Ara h 3疏水基团的含量，波长对应的峰值高于未处理组，溶液的非极性增强，三级结构发生改变；用紫外可见分光光度计测定游离巯基的含量，结果发现游离巯基的含量水平明显增加；圆二色光谱对蛋白质的二级结构进行分析，结果显示：无规卷曲角含量增加，而α-螺旋和β-折叠含量减少。
2.采用体外模拟消化试验评价湿热处理后Ara h 3的消化稳定性变化情况。结果表明：消化酶将Ara h 3条带水解为分子质量不同的蛋白。在不同的湿热处理条件下，蛋白质的抗原性随着湿热处理时间的延长和温度的升高而降低，蛋白质的结构也随之发生改变。与未处理的Ara h 3相比，在体外模拟胃消化过程中，经过不同条件湿热处理后的Ara h 3的抗原性都得到了明显的降低，在体外模拟肠消化的过程中，湿热处理后的Ara h 3抗原性与体外模拟胃消化相比又得到了进一步的降低。体外模拟消化试验结果显示，湿热处理的Ara h 3在体外模拟消化的过程中的抗原性能够明显得到降低。
参考文献（略）