第一章 前言
1.1 引言
荧光生物分析技术是利用荧光探针研究生物间相互作用，分析生物结构与作用过程的重要技术。有机荧光探针是荧光传感技术和光学成像技术的重要信号工具，这能使人类通过肉眼直接观察到生物分子水平上的作用并且提供工具观察到复杂的生物结构和进程。一般来说用作生物分析的荧光探针要求高选择性和高灵敏度。选择性一般是基于特别的识别单元和受体的相互作用。而灵敏性主要是通过探针的荧光亮度和分析物结合前后的荧光差异来实现[1]。传统有机荧光探针的光发射是容易发生淬灭的，这是因为高浓度的探针在聚集状态下容易淬灭，影响了探针的响应灵敏度。这是生物荧光传感中不愿意见到的现象，这也是科学家想极力避免的聚集诱导淬灭现象（aggregation-causedquenching，ACQ 现象）[1-7]。即使无机荧光材料如无机量子点也存在着 ACQ 现象[8]。为了避免 ACQ 效应，科学家不得不使用浓度非常低的探针来进行生物分析应用，导致了探针灵敏度下降并使痕量分析生物分子遇到障碍[2]。即使在稀浓度下，ACQ 效应也有可能存在，因为生物有机探针会趋于聚集在生物分子的表面或者在生物分子的疏水腔形成团簇，也增加了探针在局部范围的浓度。总之，许多传统探针在生物传感时无法避免地发生不灵敏的“Turn-off”模式，这种模式大大限制了探针的实际应用。当溶液中水含量增加时，其荧光强度下降。当水含量超过 70%时，荧光基本消失。这种 ACQ 现象的产生是因为 DDPD 含有一种类似光盘状的中心平面分子-二萘嵌苯，当 DDPD 聚集时，该平面分子发生π-π 堆积形成激基缔合物，导致了 ACQ 效应。ACQ 效应在传统的分子中很容易被观测到，在两亲性远红外/近红外辐射（FR/NIR）荧光团中经常能观测到 ACQ 效应，因为这种荧光团一般含有疏水的容易聚集的芳香环。研究发现主要有以下两种因素导致有机发光分子因聚集产生荧光淬灭：1.分子间的电子振动作用引发固态或聚集态的有机分子非辐射耗散能量；2.有机分子具有平面 π 共轭结构，分子间相互作用生成的激基缔合物阻碍荧光发射。科学家开发了一系列方法来解决以上问题，如通过物理方法调控分子结构等方法来限制分子间的聚集。虽然有不错的效果，但是制备合成方法的复杂和加工流程的繁琐性大大限制了这些荧光材料的实际应用[10-13]。
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1.2 典型 AIE 特征的有机分子
1.2.1 硅杂环戊二烯(Silole)
自 2001 年 Tang 发现第一个 AIE 分子 MPPS 开始，接下来一系列 MPPS 分子及其衍生物都被设计发现出来[29]。目前研究地较为完善的 AIE 体系是基于 Silole的衍生物体系。图 1. 2 和图 1.3 所示为 Silole 衍生物[2, 30-44]的小分子、大分子及其聚合物结构，它们均具有 AIE 性能。它们有 AIE 效应是由于在单分子状态下，其结构为非平面构型，边缘苯环和中心环丁烯硅烷有着一定角度，苯环结构能围绕单键自由旋转，从而产生能量耗散。但其在固态及聚集态时中，由于分子内苯环的旋转受限，荧光强度增加。例如，化合物 2 (hexaphenylsilole, or HPS) 不溶于水，微溶于甲醇，溶于三氯甲烷、四氢呋喃和乙腈。其乙腈溶液在光激发下基本没有任何荧光发射，但是当乙腈-水混合溶液的水含量超过 50%时，其分子间发生聚集而使荧光增强，当乙腈-水混合溶液中水含量达到 99%时，分子大量聚集，荧光强度相对于在纯乙腈溶液条件下提高了255倍。这说明silole分子为典型的AIE分子。
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第二章 9,10-二苯乙烯基蒽季铵盐生物探针合成及核酸适体传感
2.1 引言
核酸适体（aptamer）是一段经体外筛选技术—指数富集配体系统进化（SELEX）筛选出的具有特定功能的寡聚核苷酸片段，通常为单链 DNA（ssDNA）或 RNA。核酸适体能特异结合蛋白质或其他小分子物质，可以有效的结合相应的配体，表现出如抗体一样的高度的识别能力和亲和力。因其分子量小、制备过程简单、稳定性好、特异性强等优点，被认为是生物传感器中理想的分子识别元件[1, 2]。由于核酸适体只是一段化学合成的 DNA 或 RNA 片段，并不具有信号转换和显示的功能，而将其用于识别各种靶物质时，它与靶物质的识别本身并不能产生可检测的信号。因此，要经过合理设计或修饰，将核酸适体的识别作用，转换成为易于检测的物理信号。根据信号转换原理的不同，信号核酸适体设计中涉及的物理信号有：荧光信号、力信号、电化学信号、放射性同位素、比色信号、声波信号、表面等离子共振信号等多种[2-4]。其中荧光信号由于其灵敏度高，反应迅速，测试成本低而备受关注[5]。限制性酶或非限制性酶的DNA酶解反应在生物技术或药学等生物领域研究都有着重要意义。如 DNA 复制，基因重组，DNA 修复，分子克隆，基因分型和图谱等生物过程都涉及到 DNA 酶[6-11]。传统的酶活性分析有凝胶电泳，放射性标记，高效液相色谱法（HPLC），沉降法，比色测定，酶联免疫吸附测定，质谱等技术，这些技术都是研究 DNA 结构特征及其酶活性的重要技术。不过他们都有一些限制或缺陷，如耗时长，工作需求量大，DNA 消耗大，不连续，或者需要同位素标记[12-19]。而且关于酶活性分析大多研究的是双链 DNA（dsDNA）的限制性酶。单链特异性 DNA 酶为多功能酶家族中的一成员，广泛存在于生物体中，并对 ssDNA或 dsDNA 中的单链部分的酶切有很强的选择性。因此，发展简单、快捷、高效的单链酶活性监测及其抑制剂筛选技术有重大意义。
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2.2 实验部分
常用试剂和溶剂均为分析纯，无水四氢呋喃制备是通过加入金属钠和二苯甲酮并加热回流至二苯甲酮变蓝后，常压蒸馏获得；各种金属离子都用稀醋酸溶解，防止水解和沉淀；无水丙酮用无水硫酸镁干燥三天以上，常压蒸馏获得；无水二氯甲烷通过加入无水氯化钙回流一天以上，常压蒸馏获得。S1核酸酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司，相应的核酸酶缓冲溶液为pH 4.6的50 mM的醋酸锌和10 mM的硫酸锌，并储存在-20℃的冰箱中待用。在使用之前，所有的DNA核酸适体溶于去离子水中，通过紫外吸收光谱测定浓度，四种不同核苷消光系数为( 260 nm, M-1cm-1)： A = 15400, C = 7400, G = 11500,T = 8700.最后定量致浓度为 100 μM， 放于4℃冰箱中待用。实验室所用的缓冲溶剂除了特定缓冲溶剂外都用Tris和醋酸配置的缓冲溶剂（pH 7.2），去离子水均是通过系统Milli-Q提取的超纯水，电阻率为18.2 MΩ•cm。
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第三章 基于聚集诱导发光探针和氧化石墨烯生物传感器....61
3.1 前言...... 61
3.2 实验部分..... 62
3.2.1 试剂与仪器 ....... 62
3.2.2 探针合成 .... 63
3.2.3 荧光测试 .... 64
3.3 结果与讨论........ 65
3.4 本章小结..... 78
3.5 参考文献..... 79
第四章 细胞色素 C 诱导的自组装石墨烯量子点的生物传感 ......83
4.1 前言...... 83
4.2 实验部分..... 84
4.2.1 试剂与仪器..... 84
4.2.2 试验方法......... 84
4.3 结果与讨论........ 86
4.4 本章小结..... 93
4.5 参考文献..... 94
第五章 论文总结.........98
第四章 细胞色素 C 诱导的自组装石墨烯量子点的生物传感
4.1 前言
量子点又称为半导体纳米微晶粒，是一种直径为 1～100 nm 的发光纳米颗粒。由于小尺寸效应、量子尺寸效应、表面界面效应等使其表现出可调谐的激发波、抗漂白性、狭窄的激发波长和远离激发峰激发等优良的光学性质[1-5]。因此量子点可以作为荧光探针，广泛应用于生物标记，生物传感等生物分析中[1, 6-8]。但是量子点的生物分析应用大大受限制主要是由于其本身往往需要修饰或者标记[7, 9]。另外，量子点本身很强的毒性大大限制了在生物领域中的应用[10]。石墨烯量子点是近几年来迅速发展的一种新型纳米发光材料，由于本身具有低毒，稳定的荧光性，抗漂白性，极佳的水溶性，生物相容性，已经广泛应用与生物成像中[11, 12]。不过它作为一种荧光探针，还很少应用于生物传感中。胰蛋白酶由胰腺细胞产生，是生物体最重要的消化蛋白酶，它能酶切肽中的赖氨酸和精氨酸残基[13]。对其进行灵敏，高选择，经济的分析是至关重要的。传统的测定胰蛋白酶有放射免疫分析，明胶膜技术，比色法，电化学方法和荧光技术[14-25]。在这些技术中，荧光技术由于高灵敏度，易操作性，低信噪比而备受重视。目前报道检定胰蛋白酶的荧光分析技术有纳米金，量子点，共轭聚电解质，荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET），AIE 等技术[20-24,26]。但是这些技术都有一些各自的瓶颈，比如共轭聚电解质要求复杂的合成手段，探针标记技术的复杂性，及其探针遇到的光漂白问题，降低灵敏度的“turn-off”和量子点的高毒性。
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总结
本论文合成了新型具有聚集诱导发光性质的 DSA 探针，研究了探针的光物理性质，探索了 DSA 探针的生物传感性能，主要研究结果总结如下：设计合成了 9，10-二苯乙烯基蒽（DSA）季铵盐分子 BTAESA，研究表明，BTAESA 分子具有良好的水溶性与聚集诱导发光 (AIE) 性质，当分子通过超分子作用即静电作用与疏水作用结合到 ssDNA 上时，由于分子内的旋转受到限制，体系的荧光强度会迅速增加。这种性质使 BTAESA 分子能够做为荧光探针（探针 1）有效应用于核酸适体传感中。我们研究了不同链长（6、10、15、20、24 个碱基）的 ssDNA 对 BTAESA 探针分子荧光性质的影响，随着链长的增加，探针分子的荧光强度不断增加，且呈现很好的线性关系（R=0.998）；研究了不同浓度的含有 24个碱基长度的 ssDNA(DNA24mer)对 BTAESA 探针分子荧光性质的影响，随着浓度的增加（从 0 nM 增加到 200 nM），探针分子的荧光强度不断增加，且呈现很好的线性关系（R=0.998），检测限为 150 PM；研究了单链剪切酶 S1 对探针与 DNA24mer复合体系的荧光性质的影响，随着 S1 酶浓度的增加（从 6 到 32 U mL 1），荧光下降速率逐渐增加，具有良好的线性关系 (R=0.995)；研究了 S1 酶抑制剂对 S1 酶剪切 DNA24mer 速率的影响，随着 S1 酶抑制剂浓度的增加，探针、DNA24mer 与S1 酶复合体系的荧光下降速率逐渐降低，半抑制率（IC50）为 0.076mM。从而实现了非标记、点亮型、灵敏度高、线性关系好、简便、高效、廉价的核酸适配体生物传感。
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参考文献（略）