1 绪 论
1.1 问题提出和研究意义
随着全球工业化的发展，环境污染日益严重，大气臭氧层受到严重破坏，到达地表的紫外线越来越多，因此紫外线对人体皮肤的影响逐渐成为人们生活中的一大焦点。紫外线照射可诱导 ROS 产生，激活 MAPK 等相关信号通路，引起下游基因 MMPs 的高表达，进而不断降解细胞外基质中的胶原和弹性纤维等成分，导致皮肤发生光老化(photoaging)。皮肤长期受日光照射所引起的积累性损害称为光老化。紫外线还能与其它环境因素(如吸烟，化学物质等)共同作用引起多种皮肤疾病如日晒伤、多形性日光疹、皮肤肿瘤，甚至诱发皮肤癌。紫外线所致的一系列皮肤性疾病严重影响了人们的身心健康，并给其家庭、社会和国家带来沉重的经济负担。因此，如何预防及修复紫外线引起的损伤成为皮肤-光生物学研究的一大热点，众多研究者在研究紫外线损伤的同时，也一直在探寻皮肤抗氧化应激的抗氧化剂。许多抗氧化剂不断的应用到皮肤抗氧化应激领域中，并取得一定的临床效果。其中维生素 E 在皮肤抗氧化中的研究中已取得丰富成果，如延缓体内衰老基因表达，逆转衰老相关的免疫功能衰退，防止紫外线照射和臭氧所造成的损伤，维持皮肤年轻化，防止皮肤出现皱纹、黄褐斑、甚至肿瘤等。最近，对抗氧化酶的研究已成为一大热点，其中 HO-1 在多种组织和器官中发挥着重要的保护效应，它能抵抗多种外界刺激引起的氧化损伤。研究发现多种天然抗氧化剂都能诱导HO-1 的表达以达到抗氧化损伤的作用，而维生素 E 是否能通过诱导 HO-1 的表达对皮肤光老化产生一定的保护作用尚不明确。因此，本课题在上述假设的基础上，通过 UVA 照射人皮肤成纤维细胞构建细胞的损伤模型，初步探究天然抗氧化剂维生素E能否通过诱导HO-1的表达而达到抑制UVA照射诱导的MMPs生成的目的，这将为紫外线光损伤的防护和治疗以及进一步对维生素 E 进行化学修饰或结合纳米材料提高抗氧化效率提供一定的理论依据，并为重点开发新的皮肤防晒剂和抗皮肤衰老产品提供一定的指导方向。
1.2 国内外研究现状
1.2.1 紫外线对皮肤的影响
皮肤作为最大的器官覆盖人体和动物的全身，是身体与外界接触的第一道防御保护线。皮肤具有十分重要的生理功能，如保护机体内的组织和器官免受外界刺激引起的损伤，保持、调节机体生命活动所需的温度，参与机体的免疫调节过程，它还具有吸收、分泌、排泄等生理功能。皮肤作为内部器官和环境之间的防御屏障，直接暴露在外界环境中，主要受紫外线照射产生的氧化应激影响[1]。氧化应激是机体内氧化与抗氧化系统的平衡发生紊乱所引起的损伤效应，主要表现为细胞、组织发生氧化损伤，机体衰老，皮肤性疾病，甚至诱发肿瘤等恶性疾病[2]。人体皮肤在组织结构学上由外向内可分为表皮、真皮、皮下组织3层。表皮由鳞状角质化上皮细胞构成，具有物理性保护屏障的功能，能参与免疫、炎症等复杂的生物学过程，维持机体的内环境稳态[3]。真皮主要由成纤维细胞与胞外基质中的胶原蛋白和弹力纤维等成分构成。胞外基质除了胶原蛋白和弹力纤维，还含有 II、III、V、VII 型胶原，弹性蛋白，蛋白聚糖，纤维连接蛋白和其他细胞外基质蛋白[4]。I型胶原是皮肤结缔组织中含量最丰富的蛋白质，新合成的 I 型前胶原蛋白经细胞分泌到真皮细胞外间隙中，经过酶代谢后，最后形成一个三螺旋空间结构的复合体，又与其它小分子蛋白多糖结合，形成排列整齐的胶原纤维束，为皮肤提供韧性和抗拉性，而弹性纤维则为皮肤提供弹性，蛋白多糖在其中发挥着保湿和生物信号传导作用。真皮层还包括巨噬细胞、脂肪细胞、浆细胞和肥大细胞等，这些细胞与周围的神经纤维、血管及淋巴管交织在一起，为表皮层提供丰富的营养，促进表皮细胞的分化、增殖和迁移[3]。
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2 长波紫外线对人皮肤成纤维细胞损伤模型的建立
2.1 引言
UVA 在紫外线中所占的比例最高，并具有极强的穿透能力，能够穿透表皮、真皮层，甚至皮下组织。UVA 与细胞内的色基作用产生 ROS，可导致 DNA 氧化损伤，引起光化性皮肤过敏并加剧多种炎性皮肤疾病的发生，甚至诱发皮肤癌，因此 UVA 在皮肤光损伤中的作用日益受到重视。皮肤作为机体的第一道防御保护屏障，能抵挡外界刺激对体内组织和器官的侵害，维持机体内稳定健康的内环境，尤其是对维持真皮胶原蛋白和弹性纤维的形态不被降解具有重要作用，而这些功能主要由皮肤表皮的角质形成细胞和真皮的成纤维细胞完成。FEK4 细胞(人真皮成纤维细胞)是由英国巴斯大学 Tyrrell 教授组惠赠所得，FEK4 细胞具有培养简单、易于增殖的优点，是体外研究紫外线损伤皮肤产生一系列生物学效应的理想模型细胞。因此，我们通过检测 UVA 照射 FEK4 细胞的增殖活性、细胞形态、细胞内ROS 水平和细胞内 MMP-1、MMP-2、MMP-3、Col I、Col III、HO-1mRNA 的表达变化及 Col I、HO-1 蛋白的表达变化，建立 UVA 照射对 FEK4 细胞的氧化损伤模型。
2.2 实验材料
2.2.1 实验仪器
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3 维生素 E 对 UVA 导致人皮肤成纤维细胞光老化保护作用的研究 ...29
3.1 引言 .......................................29
3.2 实验材料 .................................29
3.3 实验方法 ..............................30
3.4 结果 ....................................31
3.5 讨论 .....................................37
4 结论与展望..............................40
4.1 主要结论 ..............................40v
4.2 后续研究工作的展望 ................... .40
3 维生素 E 对 UVA 导致人皮肤成纤维细胞光老化保护作用的研究
3.1 引言
长期紫外线照射能引起皮肤细胞产生 ROS，一般情况下，紫外线照射产生的ROS 能够被细胞内的抗氧化系统及时清除，但过量的 ROS 会破坏机体内氧化与抗氧化系统的平衡，从而引发一系列有害的生物学效应。如紫外线辐射会导致皮肤灼伤、降低免疫系统抵抗感染、过早衰老、发生癌症。此外，紫外线照射诱导 MMPs合成增加，使皮肤真皮纤维结缔组织降解，形成光老化。所以找到能永久保护和预防紫外线辐射产生的副作用的方法迫在眉睫。非酶类性抗氧化剂，例如维生素(维生素 C、维生素 E)、黄酮类和酚酸等，在对抗自由基的过程中起主要作用。其中维生素 E 作为一种自由基清除剂和柔肤剂，可以保护动物和植物细胞免受紫外线诱导的膜损伤；对皮肤局部应用可以减轻急性和慢性光损伤；α-生育酚和三烯生育酚能有效减少皮肤粗糙、皱纹的长度和皱纹的深度；局部应用维生素 E 还能增加角质层的水合作用，增加其保湿能力。酶类抗氧化剂中 HO-1 是体内最易被诱导表达的抗氧化酶，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等生物学功能，参与多种疾病的治疗过程，但它在我们研究的皮肤系统中发挥的作用还不十分明确。因此本文主要研究维生素E能否通过改变HO-1的表达对皮肤细胞产生一定的保护作用，以及HO-1对 UVA 诱导的 MMP 是否具有一定的调节作用，进一步明确维生素 E 和 HO-1 对皮肤光老化的保护作用。
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4 结论与展望
4.1 主要结论
本研究建立了 UVA 照射对人皮肤成纤维细胞 FEK4 的氧化损伤模型，检测了不同剂量 UVA 照射对人皮肤成纤维细胞 FEK4 的氧化损伤作用，以及不同浓度维生素 E 对生理剂量 UVA 照射引起的光损伤的防护作用。结果证明：① UVA照射能引起 FEK4 细胞的氧化损伤，且其损伤程度随 UVA 照射剂量的加大而增强。②维生素E能恢复UVA照射后细胞的增殖活性，降低UVA照射后细胞内ROS水平，保护 UVA 照射后细胞的形态结构，减缓细胞内胶原 Col I、Col III 的降解速度。虽然维生素 E 本身也能诱导 MMP-1 的表达，但维生素 E 预处理后能降低 UVA照射后诱导的 MMP-1、MMP-2、HO-1 表达。
4.2 后续研究工作的展望
在本项目的研究过程中，我们初步发现 UVA 诱导 FEK4 细胞中 MMP-1 的表达可能与 HO-1 的调节有关，但 HO-1 对 MMP-1 的作用机制仍有待进一步的探究和证实，因此我们的后续研究工作将从以下几个方面进行：①运用基因干扰等手段深入探究 HO-1 在 UVA 诱导 MMPs 表达中的具体作用机制，包括其上游、下游基因在此过程中的作用，为 HO-1 在 UVA 诱导的光损伤中的应用提供一定的指导思路。②研究发现多数抗氧化剂都能通过诱导 HO-1 的表达对皮肤等组织发挥保护性作用，但是由于它们中的不少抗氧化剂存在低溶解度、低渗透性，保存不稳定等缺点使他们的应用范围受到很大的局限性。若能将纳米材料或新型药物分子合成技术结合到天然抗氧化剂中可能会提高其稳定性和水溶性，从而促进皮肤对抗氧化剂的吸收能力，保证抗氧化剂在体内有效稳定的起到抗氧化的作用。同时新型技术的应用若能加强抗氧化剂对 HO-1 的诱导表达，很有可能会大大提高抗氧化剂的防护作用，为抗衰老产品的研制和开发提供更合理有效的发展平台。
参考文献（略）