第 1 章 引 言
1.1 流行性感冒概况
流行性感冒（简称流感）是一种具有较短的潜伏期和患病期，可致命的急性呼吸道传染病。其临床特征一般表现为：发烧,头痛，全身无力，肌肉疼痛，以及咳嗽，咽喉疼痛，鼻塞、流鼻涕等上呼吸道感染症状。流感患者一般在患病后的一到两周内能彻底恢复，但是对于诸如儿童，老人和患有其他慢性病（如糖尿病，心脏病，癌症等）等体质虚弱的患者而言，流感可能会引发严重的肺炎，气管和支气管炎、中耳炎、心肌炎等并发症，甚至因继发感染导致死亡[1]。流感具有极强的传染性，一旦爆发很快就能引起大面积流行，甚至造成世界性大流行。上世纪至今共发生过三次流感的世界大流行，即 1918-1919 年的西班牙流感大流行，1957-1958 年的亚洲流感大流行和 1968-1969 年的香港流感大流行[2, 3]。其中最严重的是1918-1919 年的西班牙流感大流行，据估计这次流感流行导致全世界20-30%的人患病，其中死亡人数高达五千多万[4]，比第一次世界大战中死亡的总人数还要多，而且死亡的绝大多数为青壮年[5]。
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1.2 流感病毒生物学特点
流感病毒在病毒分类学上属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，为有包膜的 RNA 病毒，病毒颗粒多形态或球形，直径在 50-120 纳米之间。流感病毒的基因组为分节段的单链负义 RNA，A 型和 B 型流感病毒的基因组由 8 个节段组成，而 C 型流感病毒仅含有 7 个分子节段。A 型流感病毒的基因组共编码 10 种蛋白，其中包括 8 种结构蛋白：血凝素蛋白 HA，神经氨酸酶蛋白 NA，基质蛋白 M1 和离子通道蛋白 M2，核蛋白 NP，RNA 多聚酶 PB2、PB1 和 PA。此外还有两个非结构蛋白 NS1 和 NS2。流感病毒编码蛋白的功能如表 1-1 所示。
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第 2 章 材料与方法
2.1 实验材料
实验用 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠（体重 20g 左右）购自中国医学科学院动物所。流感病毒 A/Porto Rico/8/34（PR8，H1N1）鼠适应株和流感病毒 A/Wuhan/359/95（H3N2）由中科院武汉病毒所提供，SPF 级九日龄鸡胚购自北京实验动物中心。Elispot 检测试剂盒购自 U-Cytech（荷兰），羊抗鼠亚型特异性抗体购自 Sigma(美国)，辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠抗体（HRP-兔抗鼠 Ig）、兔抗羊抗体（HRP-兔抗羊 Ig）和 FITC 标记的兔抗鼠抗体（FITC-兔抗鼠 Ig）购自 Dako (丹麦)。狗肾传代细胞（MDCK）购自中国典型培养物保藏中心，细胞培养用培养基和胎牛血清（FetalBovine Serum，FBS）购自 Hyclone（美国），细胞培养相关耗材购自德国Grenier 公司。其余未予说明的常规化学试剂均为国产分析纯。
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2.2 流感病毒传代、滴度测定及初步纯化
流感病毒在鸡胚中传代培养，PR8 病毒鼠适应株在传代前将其接种于小鼠以增强毒力：取 20g 左右的雌性 Balb/C 小鼠，每只腹腔注射 10mg/ml的戊巴比妥钠 100μl，10-15 分钟后小鼠麻醉，用微量进样器给每只小鼠鼻腔接种 50μl PR8 病毒，4 天后处死小鼠，无菌操作分离鼠肺，加 500μl 无菌磷酸盐缓冲液（PBS，8g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.92g/L Na2HPO4, 0.24g/LKH2PO4, pH7.2，过滤除菌）后，匀浆制成鼠肺悬液，4000rpm 离心 10 分钟后取上清用于鸡胚培养。鸡胚培养方法详见郭元吉等人编著的《流行性感冒病毒及其实验技术》[151]，简要介绍如下：流感病毒用无菌 PBS 适当稀释后，用注射器接种于 SPF 级九日龄鸡胚的尿囊腔内。每枚鸡胚接种 100μl 含 5 个血凝单位（Hemagglutinin Unit，HAU）的流感病毒，用石蜡封口后，在 35℃培养箱中培养 72 小时。收获前将鸡胚置 4℃过夜使其血液凝固，然后用弯头滴管收集尿囊液，分装后置-80℃保存。
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第 3 章 流感病毒 M2 蛋白胞外区的免疫原性 ...................35
3.1 本章引言 ............................................35
3.2 结果 .................................................36
3.3 讨论 .............................................44
3.4 本章小结 ......................................46
第 4 章 半胱氨酸残基对 M2 蛋白胞外区免疫原性的影响 ........47
4.1 本章引言 ...............................................47
4.2 结果 .................................................48
4.3 讨论 ................................................57
4.4 本章小结 ............................................58
第 6 章 M2e 与裂解病毒疫苗联合免疫
6.1 本章引言
在上一章中，我们研究发现，利用添加 CpG 佐剂的方法虽然增强 M2e特异性的免疫应答，但是不仅不能提高 M2e 疫苗对病毒的防护能力，在高剂量病毒攻击时反而降低了保护效果。由于 M2e 抗体不具有病毒中和能力，只能在病毒感染细胞后通过结合细胞表达的 M2 蛋白，并介导 NK 细胞产生细胞毒性作用来清除病毒，因此单纯提高 M2e 免疫应答强度可能并不会获得令人满意的病毒防护效果。相对于 M2e 抗体而言，HA 抗体具有较好的病毒防护能力，首先，HA 抗体能直接中和病毒，阻止病毒的感染；其次，HA 抗体能结合病毒颗粒，并因此激活巨噬细胞对病毒的吞噬和补体对病毒的杀伤作用，由于病毒颗粒中 M2 蛋白含量很低，M2e 抗体不能与病毒颗粒有效结合，因此也无此作用；再次，HA 抗体也能识别细胞表达的 HA 蛋白从而介导 NK 细胞的杀伤作用，这一点与 M2e 抗体的效果相同[179]。
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结 论
流感病毒 M2 蛋白由于其高度保守性，因此有可能以此为靶点研制出对不同毒株都具有广泛防护活性的流感疫苗。在本论文中，我们重点研究了流感病毒 M2 蛋白胞外区（M2e）的免疫特点以及其诱导产生对病毒防护效果的能力，所获得的研究成果如下：1. 流感病毒 M2e 具有很强的免疫原性，根据胞外区序列合成的 M2e 多肽无需载体蛋白就能诱导产生高滴度的抗体，并且能保护小鼠免于致死剂量的流感病毒攻击。此外，M2e 多肽还诱导产生特异性的 T 细胞应答，这一结果不仅说明在 M2e 存在 Th 细胞表位，还提示我们在研究 M2 疫苗防护效果时需要注意 T 细胞应答的影响；2. 我们研究发现 M2e 的半胱氨酸残基对其免疫原性有重要作用，将半胱氨酸残基定点突变成丝氨酸后不会影响 M2e 多肽的抗原性，但会使多肽的免疫原性完全丧失，不能诱导产生特异性的免疫应答。
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参考文献（略）