本文是一篇工程硕士论文，本次试验中采取的湿地植物为会仙湿地中具有可观生长优势的植物，其中苦草为沉水植物，香蒲、芦苇、华克拉莎为挺水植物，从植物地上、地下生物量区别较大，但是按植物类别分不够全面，这可能是造成试验中去除率、群落结构、代谢产物等试验结果差异性不强的原因，在今后研究课对不同植物类型进行进一步的探讨。
第 1 章 绪论
1.1 环境中抗生素的来源及危害
1.1.1 环境中抗生素的来源
四环素类、磺胺类、氟喹诺酮类等抗生素是微生物在生命代谢活动中产生的次级代谢产物，具有对其他细胞造成影响的作用[1]。在畜牧养殖、医药等行业主要利用其独特的抑菌或杀菌功能，大量用于预防或治疗疾病。特别是在畜牧养殖行业中使用抗生素，能够使畜禽的健康状况得到保证，并且在动物饲料中添加抗生素对畜禽的生长还有一定的促进作用。因此，在畜禽养殖业中抗生素使用率日渐增长，在全球范围内对兽用抗生素的年使用量至少达到了 6.3×104 t，按此发展趋势，预估在 2030 年将达到 1.07×105 t。在我国，2013 年的使用量就达 1.6×104 t，其中畜牧业占 52%；2018 年住院、门诊病人中使用抗生素人数占比分别为 70%、20%，与发达国家相比高出两倍[2]，兽用抗生素的使用量达 2.97×104 t [3] ，这使得中国成为在全球范围内抗生素使用率最高的国家之一。抗生素本身具有低螯合能力、高水溶性和难挥发等特点，加上对抗生素大量且不间断的使用，导致了抗生素在自然环境中的存在出现了持久性。抗生素在环境中来源及传播途径如下图所示。
图 1.1 抗生素来源及污染途径
1.2 磺胺类抗生素的研究概述
1.2.1 磺胺类抗生素的性质
磺胺类抗生素（SAs）是由磺胺酸衍生出的一种合成抗菌剂，基本结构为对氨基苯磺酰胺。因其优良的特性，成为了我国生产和使用程度最大的抗生素之一。磺胺类抗生素的作用机理是阻碍细菌体内四氢叶酸的合成，达到抑制细菌生命活动的目的。在过去的几十年中，磺胺类抗生素的使用量非常大，常以添加剂的形式投加在兽类饲料或药物中，以促进动物的生长和疾病的防治[24]。
图 1.2 磺胺类抗生素结构通式
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第 2 章 抗生素胁迫下根系分泌物的组成
2.1 引言
根系分泌物是植物光合作用的主要产物，并作为植物和植物根际环境中物质交换和传递信息的重要使者，不仅能够调控根际环境，还能作为根际微生物生长代谢的能源，在植物修复有机物污染介质技术中被认为是重要的驱动因素[114]。根系分泌物按功能作用分类主要有：（1）能为微生物提供所需的碳氮源的糖类和氨基酸类等；（2）可用于对抗病原菌的入侵的苯甲酸、酚酸类含有抗生素活性物质等；（3）调节植物根际和细菌之间响应的吲哚、乙酰丁香酮、高丝氨酸内酯等信号分子；（4）具有化学趋化剂活性的苹果酸、柠檬酸等；（5）具有生长因子功能类的维生素类化合物等；（6）具有特殊功能的化合物，例如酶类、甾醇类等等。分泌物中不同种类的物质将会提高根际微生物生物量和活动[115]。
根系分泌物降解有机污染物一般是通过两种途径来完成，一是利用酶系统进行直接降解。二是通过增加微生物数量和活性的间接降解。添加根系分泌物条件下，微生物对抗生素的去除效率会得到极大的提高。微生物利用有机污染物作为能源时可直接进行降解，与此相反，若微生物不能直接降解有机污染物时可通过与根系分泌物的共代谢或协同作用对有机污染物进行去除，促进有机污染物最终分解为 CO2、H2O、N2和 Cl2等小分子物质。根系分泌物通过其分泌物与微生物形成联合关系，对有机污染物进行降解、消除，缓解环境中的污染胁迫，以达到减少污染在食物链中的传播。
在前人对根系分泌物的研究中，试验植物培养时间范围在 7~15d 内不等[99, 101, 116]，因此本研究对试验植物采取 10 d 的培养周期，根系分泌物收集时间为 48 h。采用浸根法分别收集在浓度为 0.10 μg/L 的 SD、SCP 胁迫下苦草、香蒲、芦苇、华克拉莎的根系分泌物，利用 GC-MS 检测在两种抗生素胁迫下四种湿地优势植物的根系分泌物种类构成变化。
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2.2 试验材料与方法
2.2.1 样品处理及实验设计
实验中采用的四种湿地优势植物均采自于会仙湿地流域。选择植物有生长优势且密度较高的区域，尽量保证选取生长度相似的植物，例如株高、根系量、叶片数量等尽量一致。植物样品采集完成后，在进行培养前先用水轻轻冲洗，将根部以及接近根部的茎上的泥土、其他植物的残叶、螺蛳壳以及石砾等清理干净，并确保未折损及伤害到植物根系，若在清洗过程中发生折损则直接舍弃该植株。自来水冲洗干净后再用超纯水浸泡 5 分钟，目的是为了减少根茎部分还其他污染物的附着，浸泡完成后再对根茎进行冲洗三次以上。
实验设置空白组及对照组。空白组中仅有营养液及超纯水，不添加抗生素，即苦草空白组（KC）、芦苇空白组（LW）、香蒲空白组（XP）和华克拉莎空白组（HK）；对照组中分别加入 SD、SCP，以 0.10 μg/L 浓度为胁迫条件，即苦草 SD 组（KCSD）、苦草 SCP 组（KCSCP）、芦苇 SD 组（LWSD）、芦苇SCP 组（LWSCP）、香蒲 SD 组（XPSD）、香蒲 SCP 组（XPSCP）和华克拉莎SD 组（HKSD）、华克拉莎 SCP 组（HKSCP）。将清洗后的植物分组后分别放入仅添加有 Hoagland 营养液（营养液成分如表 2.1 所示）的塑料小桶中进行 10 d的水培培养，并滴加 1~2 滴百里酚抑制微生物活性。由于每种植株根系量不尽相同，因此选择芦苇、香蒲、华克拉莎等每株根系量较大的植物分别为 5 株每组，每株根系量小的苦草为 20 株每组。用锡纸将根部区域进行避光处理后，置于实验室温室大棚中进行培养，培养过程中，每日添加超纯水保证水溶液体积恒定。
10 d 水培培养结束后，利用浸提法对空白组的根系分泌物进行收集，定性检测结果作为根系分泌物在空白条件下的背景值；将对照组中的溶液换为含有浓度为 0.10 μg/L 的 SD、SCP 的 Hoagland 营养液，以抗生素胁迫条件下再培养 10 d，10 d 培养结束后同样利用浸提法收集根系分泌物，定性检测结果用于与空白组对比分析。利用浸提法收集根系分泌物时按以下步骤操作：分别将每组植物取出，用超纯水缓慢冲洗 3 次以上，确保根茎部分的抗生素没有残留。预先将收集根系分泌物的黑色广口瓶进行紫外光消毒杀菌处理，处理好后加入配置好的 2 L 0.5 mmol/的 CaCl2，滴入 2~3 滴百里酚溶液。再将清洗好的每组植物放至黑色广口瓶中，同样对根部进行避光处理，收集时间 48 h。收集时间结束后将根系分泌物先用 0.45 µm 滤纸进行抽滤后，将收集到的溶液装入密封的瓶子，并置于-20 ℃冰箱内待上机检测。
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第 3 章 植物根系分泌物对抗生素降解效果的影响 ...................................... 42
3.1 引言 ........................................... 42
3.2 试验材料与方法 .......................................... 42
第 4 章 SD 及 SCP 的生物降解机理 ................................... 56
4.1 引言 ........................................... 56
4.2 试验材料与方法 ............................ 56
第 5 章 结论与展望 ....................................... 74
5.1 结论 ............................................ 74
5.2 建议 ............................................... 75
第 4 章 SD 及 SCP 的生物降解机理
4.1 引言
SAs 的微生物降解实际上是在将其分解为小分子化合物、H2O 和 CO2等化学反应过程。水解、缩合、脱羧、异构化、氧化、还原等化学反应都属于 SAs 主要降解途径。生物降解技术对抗生素的污染处理有非常可观的效果和较多的优点，例如方法成本低，环境友好性强等。目前有许多对于 SAs 抗生素降解菌株的筛选及特性的研究，例如 P.chrysosporium 和担子菌中的锰过氧化物酶在对磺胺类抗生素的降解中有一定的作用，Microbacterrium sp.BR1 进行接种后在 24.5 h后可将 SDM、SDZ、SMX 完全降解[83, 126, 140]；由 Acinetobacter 菌属中分离出来的 Acinetobacter sp.HS51 和 Acinetobacter W1 经试验证明，两者对 SAs 都有良好的降解能力，前者在 2 d 内对 STZ 的降解率达到 67%，后者在 24 h 内对 SMX 的降解率可达到 95%~100%，并且最佳降解环境条件为 T=25 ℃，pH=7.0[81]。但是自然环境中的菌群并不是单一的，微生物之间互存在竞争抑制的关系，所以在SAs 降解时，微生物群落结构不同会导致降解效果存在差异性。不同的抗生素种类、抗生素初始浓度、环境中营养物质的构成、pH 值等条件都会对微生物群落结构发生变化而有一定的影响，从而对抗生素的降解过程产生干扰。
自然环境中 SAs 的生物降解会被多重因素所影响，从而使去除率、代谢产物的种类而发生改变，又因在自然环境中生态系统和工程生态系统的原位降解菌主要菌群有较大差异性，其自身降解能力在纯培养条件下会有所出入。因此为探究 SAs 在不同根际环境中的生物降解效率和途径，利用不同湿地植物根际对 SAs降解特性和机理研究十分重要。
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第 5 章 结论与展望
5.1 结论
（1）相同种类的植物在选择时均选取生长趋势一致的进行水培。利用浸根法收集根系分泌物，用 GC-MS 对空白条件下和分别在 0.10 μg/L 浓度 SD、SCP胁迫条件下的苦草、香蒲、芦苇、华克拉莎四种湿地植物的根系分泌物组成成分进行测定，总共检出烷烃类、酯类、醛类、酰胺类、醇类等五类有机化合物，仍有部分化合物未能够检测出。在空白条件下和抗生素胁迫条件下，根系分泌物的组成成分中种类和相对含量有一定的差异性，检出的有机化合物在数量上差异不大，但是抗生素胁迫条件下种类会减少，其中有机酸的相对浓度会增高，在 SD胁迫下，四种植物中相对浓度占比最高的有机酸均为油酸甲酯，在芦苇根系分泌物中相对浓度最高，达 31.88 %；在 SCP 胁迫下，苦草、香蒲中相对浓度占比最高的是油酸甲酯，在芦苇和华克中对浓度占比最高的是反-9-十八碳烯酸甲酯，芦苇中的反-9-十八碳烯酸甲酯相对浓度在四种植物中达到最高，为 23.22 %。
（2）在苦草、香蒲、芦苇、华克拉莎四个植物组在 pH 值和温度不同的根际环境条件下，去除率有所差异，四个植物组对 SD、SCP 去除率范围整体上由高到低排序为华克组＞芦苇组＞香蒲组＞苦草组，与空白组相比，添加了根系分泌物对微生物降解抗生素有较明显的促进作用。对于四种湿地植物组而言，微生物降解最佳根际环境条件范围为：25~30 ℃，pH 值 6~7 范围内的去除率均较高。在同一 pH 值条件下，温度的升高能使去除率有明显的提高，其中 15 ℃时去除率为最低，在同一温度条件下，环境 pH 值过酸或过碱都会影响微生物对抗生素的降解。植物组在对 SD、SCP 进行降解时，去除率会存在差异，整体来说，苦草组、华克组对 SD 的去除率高于 SCP，香蒲组对两者去除率较为相近，芦苇组对 SCP 的去除率要高于 SD。
（3）通过对 96 h 内的浓度-时间变化曲线来看，随时间的增加，去除率会逐渐升高，但每个植物组中去除率变化的幅度不相同，可能是与微生物群落的响应机制有关。在对根际土壤进行微生物群落结构检测，发现在初始土壤中，四种植物群落结构在门、属水平上较为相似，但是在经过 96 h 的抗生素降解后，每个植物组中的优势菌属会发生改变。在 96 h 后对植物组中的抗生素代谢产物进行分析，发现每个植物组中 SD、SCP 的代谢产物相同 ，由此可推断出 SD、SCP在植物根际中可能的微生物降解途径，主要发生的反应有羟基化、氨基化以及 C-S 键、S-N 键的断裂等。
参考文献（略）