1壳聚糖-硬脂酸嫁接物的合成及其理化性质研究
本研究采用壳聚糖酶将高分子量的壳聚糖降解，制备低分子量的壳聚糖(chitosan, CS)；以碳二亚胺（EDC)为交联耦合剂，将疏水性的硬脂酸共价结合到壳聚糖的氣基上，合成得到壳聚糖-硬脂酸嫁接物（stearic acid graftedchitosan, CS-SA)。以核磁共振氢谱确证嫁接物的化学结构；以三确基苯横酸法测定嫁接物的氨基取代度；以苗焚光法测定嫁接物在水中的临界胶团浓度；采用微粒粒度及表面电位分析仪测定嫁接物胶束在水溶液中的粒径和表面电位；釆用透射电镜观察壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的形态和大小。
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂
壳聚糖（chitosan,分子量450kDa，脱乙酰度为95%，浙江玉环海洋生物化学有限公司），壳聚糖酶（chitosan, Dyadic International, Inc., America ),葡聚糖标样（polymer laboratories Ltd., USA),硬脂酸（Stearic acid, SA,上海化学试刻厂），碳 二亚胺（Sigma Chem.Co., St.Lousi, USA ),三销基苯横酸（SigmaChem.Co.，St.Lousi，USA ),花(pyrene, Aldrich Chem.Co., USA ),盐酸（杭州化学试剂有限公司），碳酸氢纳（上海虹光化工厂），其他溶刻和试剂均为分析纯或化学纯。
1.1.2仪器
BS110S电子天平（此京赛多利斯天平有限公司），集热式恒温加热磁力挽掉器(巩义市英略予华仪器厂)；核磁共振仪（AC-80，Brucker Biospin Co., Germany ),紫外透射成像系统（Universal Hood II，BioRad Co., USA ),超声波清洗器(USC-202,上海波龙电子设备厂）；微粒粒度与Zeta电位分析仪（3000HS,MalvemCo.，UK),透射电子显微镜（TEM, STEREOSCAN, LEICA, England ),二氧化壤细胞培养箱（3110，Thermo Form Co., USA); XW-80A旋祸混合器（上海医科大学仪器厂），TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造)，紫外分光光度计(UV-1800,北京普析通用仪器有限公司)，焚光测定仪（F-2500, HITACHI Co., Japan ),电热恒温水浴锅（DK-S24，上海精宏实验设备有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9M5A,上海一恒科技有限公司）。
1.2实验方法
1.2.1低分子量壳聚糖的制备及分子量测定称取
壳聚糖（chitosan,分子量 450 kDa ) 20 g，加入 1000 mL 1.25% (v/v)盐酸溶液中，榄拌使其溶解。水浴加热，55°C温度下，缓慢加入壳聚糖酶水溶液（约lU/mL),挽拌使其完全溶胀，400rpm55°C保温条件下进行壳聚糖的降解反应。反应结束后，加热反应体系至80。C使壳聚糖酶失活，终止反应。加入0.3%(w/v )的活性炭，室温搅拌30min。4000 rpm条件下离心lOmin,除去活性炭。上清液则进一步用微孔滤膜（0.45^im水膜）过滤，得到壳聚糖水溶液，喷雾干燥得壳聚糖粉末。凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量[3G]。釆用TSK凝胶柱（G3000SW ),流动相为0.1 M醋酸纳溶液（pH 6.0);柱温：25°C，流速为0.8mL/min,进样量以分子量为5.9，11.8，22.8, 47.3, 112kDa的葡聚糖标样制备标准洗脱曲线，以洗脱曲线计算壳聚糖分子量。
1.2.2壳聚糖-硬脂酸嫁接物（CS-SA)的合成
采用碳二亚胺（l-ehytl-3-(3-dimethylmainopropyl)carbodiiniide，EDC )法合成壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取壳寡糖（17.5 kDa) 1.0 g,加去离子水60mL搜拌溶解。取处方量硬脂酸（stearic acid, SA),溶于40mL乙醇，加入处方量EDC,60。C搅拌30min。混合上述两种溶液，于400 rpm磁力搜拌，控制80。C反应4将终反应液置透析袋中（MWCO 7Kda, Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA)透析48h，除去水溶性副产物。透析液冷冻干燥，得嫁接物固体粉末。固体粉末分散于无水乙醇中，水浴超声15min (40W)，用0.45叫微孔滤膜过滤，除去未反应的硬脂酸，重复操作3次，取过滤固体产品，复溶于蒸馆水中，冷冻干燥，得到纯化的壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
2壳聚糖-硬脂酸嫁接物/蛋白质/DNA三元复合物的制备及基因转染行为研究
采用乙酰氯催化法醋化牛血清白蛋白（BSA)合成不同等电点的蛋白。Zeta电位法测定蛋白等电点。共孵育法分别制备CS-SA/DNA 二元复合物和含有不同等电点的CS-SA/BSA/DNA三元复合物。微粒粒度与表面电位测定仪测定二元复合物及三元复合物的粒径与表面电位；透射电子显微镜观察纳米粒的形态；凝胶电泳分析嫁接物胶束与DNA的密接程度。以表达绿色焚光蛋白质粒DNA(pEGFP-Cl)作为报告基因，HEK293细胞为模型细胞，焚光倒置显微镜观察绿色焚光蛋白表达，流式细胞仪测定转染效率。比较二元复合物及三元复合物的转染差异。激光共聚焦观察复合物纳来粒的细胞摄取及胞内释放行为，流式细胞仪定量摄取效果。MTT法考察给药系统的细胞毒性。考察不同等电点的蛋白对基因转染效果的影响，探讨其可能机制。
2.1试制与仪器
2.1.1试剂
壳聚糖-硬脂酸嫁接物（stearic acid grafted chitosan oligosaccharide, CS-SA ).牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA,碧云天），鱼精 DNA( fish sperm DNA.上海生工生物工程技术服务有限公司），绿色焚光蛋白真核表达质粒pEGFP-Cl(上海申能博彩生物科技有限公司），溴化乙錠（ehtidium bromide, EtBr, Sigma,America),异硫氰基焚光素（fluorescein isothiocyanate, FITC，Sigma, USA ),d塞唾兰 mTT( 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, Sigma,USA ), Lipofectamine? 2000 (Invitrogen Co., USA)，细胞培养基 DMEM (GibcoBRL, USA),胰蛋白酶（Trypin，Gibco BRL, USA)，胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），绿色焚光蛋白质粒pEGFP-Cl (浙一医院赠送），四甲基罗丹明TAMRA标记的DNA ( DNA为反义核苷酸LY2181308 ,序列为5'-TGTGCTATTCTGTGAATT-3',上海生工生物技术公司),溶酶体标记试剂Lysotracker (LysoTracker? Blue DND.22, Invitrogene, USA)。
3壳聚糖-硬脂酸嫁接物/蛋白质/pshSUR三元复合物........37
3.1试剂与仪器.......37
3.1.1 试剂....... 37
3.1.2 仪器....... 37
3.2 试验方法....... 38
3.2.1 细胞培养....... 38
3.2.2 Survivin shRNA重组质粒的合成与抽提....... 38
3.2.3 实时荧光定量PCR (Real time-PCR )法的建立....... 38
3.2.4 Real time-PCR 法选择最佳 survivin shKNA ....... 40
3.2.5壳聚糖-硬脂酸嫁接物/蛋白质/pshSUR....... 40
3.2.6对MCF-7细胞的化疗增敏作用评价....... 41
3.2.7对MCF-7/Adr细胞逆转耐药作用评价....... 41
3.3 结果与讨论....... 41
3.3.1 Real time-PCR 法的建立 .......41
3.3.2 最佳 survivin shRNA 重组质粒（pshSUR )的选择....... 43
3.3.3壳聚糖-硬脂酸嫁接物/蛋白质/pshSUR....... 44
3.4 小结....... 47
4 结论....... 49
结论
本研究主要取得了以下成果：
1.通过碳二亚胺介导，实现对壳聚糖的疏水性修饰，得到两亲性的壳聚糖-硬脂酸嫁接物（CS-SA)。核磁共振氢谱确证了壳聚糖-硬脂酸嫁接物的化学组成，该嫁接物的氨基取代度为7.4%,在水中易自聚成胺束，临界胶束浓度为81.0在水溶液中浓度为1 mg/mL的嫁接物胶束粒径为36.4 ±0.9 nm,电位为32.7 ±1.2mV?胶束呈球形，分布均一。
2.通过乙酰氯催化法合成了等电点分别为4.7、6.0和9.3的BSA。嫁接物胶束可有效密接质粒DNA形成粒後均一的二元复合物。釆用共孵育法制备CS-SA/BSA(4.7)/DNA、CS-SA/BSA(6.0)/DNA、CS-SA/BSA(9.3)/DNA 三元复合物.当BSA含量较低时，所形成的三元复合物的粒径与二元复合物相比较差异不是很明显，且粒径均小于200 nm。当WbsaA^cs-sa比由0.1增至0.5时，嫁接物仍可有效密接DNA。体外基因转染结果显示：BSA的等电点显著影响嫁接物介导的基因转染效率。与二元复合物相比，CS-SA/BSA(6.0)/DNA三元复合物的基因转染效率略有增加；CS-SA/BSA(4.7)DNA转染效果进一步增加，且接近阳性Lipofectainine?2000对照；而CS-SA/BSA(9.3)/DNA对转染效率起抑制作用。采用等电点为4.7的BSA促进基因转染的效率，在于其负电荷性质促进基因药物的释放。
3.本研究建立了准确可靠的实时荧光定量PCR ( Real time-PCR )方法学，并采用Real time-PCR技术餘选出最佳干扰质粒。以三元复合物给药系统基因治疗结合紫杉醇的化疗研究结果表明，经基因治疗后可有效增加耐药细胞MCF-7/Adr对紫杉醇的敏感性，其逆转耐药倍数为9倍，而对敏感细胞MCF-7无明显作用。
参考文献
[1] Niidome T，Huang L. Gene therapy progress http://sblunwen.com/jygc/ and prospects: nonviral vectors. GeneTherimi, 9 (24): 1647-1652.
[2] Simonelli F, Maguire AM, Testa F，Pierce EA, Mingozzi F, Bennicelli JL, et al.Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 yearsafter vector administration. MolTher 2009, 18 (3): 643-650.
[3] Takahashi Y，Nishikawa M，Takakura Y. Nonviral vector-mediated RNAinterference: its gene silencing characteristics and important factors to achieveRNAi-based gene therapy. AdvDrugDeliv Rev 2009, 61 (9): 760-766.
[4] Yanez RJ，Porter AC. Therapeutic gene targeting. Gene Ther 1998, 5 (2): 149-159.
[5] Rao DD，Vorhies JS，Senzer N，Nemunaitis J. siRNA vs. shRNA: similarities anddifferences. Adv Drug Deliv Rev 2009, 61 (9): 746-759.
[6] Guo P，Coban 0，Snead NM，Trebley J, Hoeprich S，Guo S, et al. EngineeringRNA for targeted siRNA delivery and medical application. Adv Drug Deliv Rev 2010,62 (6): 650-666.
[7] Ambrosini G，Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene，survivin,expressed in cancer and lymphoma. Nat Med 1991^ 3 (8): 917-921.
[8] Canine BF，Hatefi A. Development of recombinant cationic polymers for genetherapy research. Adv Drug Deliv Rev 2010, 62 (15): 1524-1529.
[9] Marshall E. Gene therapy death prompts review of adenovirus vector. Science 1999,286 (5448):2244-2245.
[10] Tros DIC，Sun Y，Duzgunes N. Gene delivery by lipoplexes and polyplexes. Eur JPharm Scm、, 40 (3): 159-170.