第 1 章 文献综述
1.1 肝细胞癌遗传学、表观遗传学及分子途径研究进展
1.1.1 肝细胞癌流行病学
肝癌是世界范围内最常见且恶性程度最高的肿瘤之一，根据世界卫生组织GLOBOCAN 2008 数据统计，位居男性恶性肿瘤发病率的第五位，死亡顺位的第二位，女性恶性肿瘤发病率的第七位，死亡顺位的第六位。在 2008 年世界范围内新发病例有 748，300 人次，死亡病例有 695，900 人次，其中男性是女性的二倍以上，超过 50%的新发病例和死亡病例都发生在中国[1, 2]。全世界各地 HCC 发病率不尽相同，其中以东南亚和非洲的中部、东部地区为最高，其次是中亚西亚，北欧和东欧地区。HCC 高发地区同时也是 HBV 感染的高发区，在这些地区超过 8%的人群存在慢性 HBV 感染[3]。在原发性肝癌中，肝细胞癌是最主要的组织学类型，占全部肝癌的 75-80%[4]。研究表明，一些肝癌患者具有明显的家族聚集性和遗传易感性，提示肝癌的发生可能与遗传因素有关。但要指出的是，肝癌发生涉及多因素、多步骤的癌变过程，单一因素可能不能直接导致肿瘤发生，往往有多种因素协同作用如，HBV/HCV 感染合并 AFB1 食物污染、酗酒和吸烟则明显提高肝癌的发病。HCC 最主要的病因为 HBV/HCV 感染。发展中国家 60%的肝癌患者病因为HBV 慢性感染，33%的肝癌患者为 HCV 感染；而发达国家的比例分别为 23%和 20%[5]。HBV 携带者比 HBV 阴性者的肝癌发病率高 100 倍[6]。黄曲霉毒素 B1（AFB1）暴露协同 HBV 感染可以增加患 HCC 的几率[4-7]。在美国和其它发病率较低的西方国家中，酒精性肝硬化和同肥胖相关的非酒精性脂肪肝被认为是肝癌的主要原因[8]。值得注意的是，近几年 HCC 的流行病学发生变化,美国和中欧地区的 HCC发生率由低发病区进入高度发病区，可能与这些地区肥胖的流行及因注射性毒品滥用导致的 HCV 感染升高有关。而一些高发区，如中国大陆和香港地区，由于HBV 疫苗的广泛接种[8-10]，HCC 发病率明显下降。尽管在 2006 年全世界范围内仅有 27%的婴儿按照 WHO 的推荐在出生 24 小时之内接种了第一剂 HBV 疫苗，但到 2008 年，已有 177 个国家（91%）将 HBV 疫苗接种加入全国性婴幼儿免疫计划中[11]，对降低 HBV 感染率及 HCC 的发病率起到很大作用。对于目前尚无免疫疫苗的 HCV 感染，预防策略包括筛查献血者的 HCV 抗体和注射性毒品使用者针头的管制。在非洲撒哈拉地区，通过改善农作物储存方法降低黄曲霉毒素的污染后，对 HCC 发病率的下降也起到明显效果[12]。
1.1.2 肝细胞癌遗传学研究进展
1.1.2.1 肝癌基因组不稳定性、基因突变
肝细胞癌同其他肿瘤一样，存在基因组不稳定性或遗传学不稳定性[13, 14]，表现为染色体不稳定性即非整倍体性(aneuploid)以及结构变异包括基因突变、重排、拷贝数变异等。随着人类基因组序列的完成，人们开发了全基因组范围检测肿瘤细胞染色体异常的新型技术，如基于微阵列或称基因芯片的比较基因组杂交(microarray comparative genomic hybridization, arrayCGH)技术能在更高的解析度发现肿瘤基因组的异常。国际上Midorikawa等[15]利用高通量寡核苷酸arrayCGH技术对36例原发性肝癌样本中基因组DNA拷贝数的水平进行分析，发现肝癌细胞基因组多个染色体区段发生异常改变。其中扩增区常见于染色体1q，5p，5q，6p，7q，8q，17q和20q。而杂合缺失(loss of heterozygosity, LOH)区常见于1p，4q，6q，8p，10q，13q，16p，16q和17p，提示这些异常与肝癌的发生有密切的关系。以上工作为分离更多的肝癌致病基因提供了精选定位数据。国家人类基因组南方研究中心科研人员基于cDNA基因芯片(13824个基因或ESTs)的CGH分析了41例肝癌样本，发现平均7.25%基因组发生了DNA拷贝数的变化。基因组拷贝数扩增区多集中在染色体1q，6p，8q和9p；而LOH区多发生在染色体1p，16q和19p，绘制了较为精细的肝癌全基因组异常图谱[12]。除了染色体存在不稳定外，肝癌样本也存在一些基因的突变，导致抑癌基因失活或者癌基因活化。已证实抑癌基因p53基因的失活与HCC的发生发展密切相关。众多研究表明HCC常发生高频率p53基因的LOH（25%-80%），p53第249位密码子突变外及其他密码子突变也被证实与肝癌的发生发展有密切的关系[16-20]。最近，其他抑癌基因如PTEN等也受到重视，研究者发现一些(9.5%)肝癌患者PTEN存在第5和8外显子的突变[21]。与机体发育和细胞分化功能相关的Wnt/β-catenin也被累及，Terris等人[22]发现β-catenin基因第3外显子在肝癌的突变率是19%(14/73)，突变导致β-catenin蛋白稳定性增加，导致β-catenin蛋白聚集、活性增加引发肝癌肿瘤基因组不稳定性和基因突变等的异常会影响基因的转录表达。
第 2 章 实验研究
在前文文献综述中已总结归纳了目前文献报导过的肝细胞癌中因异常甲基化灭活的 64 个基因，这些基因广泛散布在各条染色体上，基因功能涉及到细胞生长、发育、分化、凋亡等各种生物学过程，包括多种细胞信号通路，如 p53 通路、TGF-β 诱导的抗肿瘤途径、STAT 信号通路、RAS/ERK 途径、AKT/PKB 途径等详见表 1.1。本研究在前人研究的基础上，主要针对其中的 WNT/β-catenin 信号途径中的相关基因，应用甲基化特异性 PCR（MSP）及硫化测序法（BS），检测其启动子区甲基化状态。由于 BS 法尤其适用于鉴定某个基因在某种状态下的甲基化状态，如肿瘤组织中，目前重亚硫酸盐转换、PCR 扩增的基因组 DNA 测序已经成为分析、比较特殊位点甲基化方式的金标准。应用这两种方法可以实现对特定基因甲基化方式的定性、定量、定点研究。其次，本实验中心前期工作中应用 array-CGH 技术，对中国东北地区 45 例肝细胞癌组织进行了基因组水平研究，检测了肿瘤组织基因组 DNA 拷贝数的变化，绘制出了基因组失平衡染色体图谱，此研究将 WNT/β-catenin 信号途径中的某些相关基因在该图谱上定位，得到这些基因的 DNA 拷贝数变化信息后，综合分析了此信号通路在遗传学水平及甲基化状态即表观遗传学水平的异常改变。对肝细胞癌中非常重要的 WNT/β-catenin 信号途径进行了较为全面的研究。
第 2 章 实验研究.......21
2.1 肝细胞癌基因组不稳定性、基因突变....23
2.1.1 WNT/β-catenin 信号途径相关基因….. .23
2.1.2 抑癌基因 APC、PTEN、TP53 突变检测.....27
2.1.3 讨论........382.1.4 小结........40
2.2 WNT/β-catenin 途径相关基因启动子.....41
2.2.1 实验材料....41
2.2.2 实验方法....41
2.2.3 结果........50
2.2.4 讨论........58
2.2.5 小结........60
结论
1、 肝癌细胞基因组存在广泛的基因组不稳定性，多个染色体区段发生异常改变。其中扩增区常见于染色体 1q，5p，5q，6p，7q，8q，17q，20p 和 20q。而 LOH 区常见于 1p，4q，6q，8p，9p，13q，14q，16p，16q，17p，18q 和 21q。
2、 WNT/β-catenin 信号途径中的 6 个相关基因 （APC、FZD9、SFRP1、SOX17、WIF1 和 WNT2）在肝癌中呈异常甲基化。我们前期实验工作发现，这 6 个基因的 DNA拷贝数在肝癌中呈明显扩增，但根据文献报道，这些基因在肝癌中均表达下调。提示基因异常甲基化对基因沉默起到作用。FZD9、SFRP1、SOX17、WIF1 和 WNT2 异常甲基化有潜力作为肝癌早期诊断指标之一。
3、 AXIN2 在肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织和外周血中均未发现异常甲基化，而在直肠癌、肺癌等肿瘤中常见。
4、 在 20 例肝癌样本，我们分别在 1 例病例中检测到抑癌基因 APC、PTEN、TP53体细胞突变，其中 APC、TP53 阳性病例中，同时合并有 LOH，提示 APC、TP53 的异常对肝癌发生发展的作用。
5、 基因突变、杂合性缺失（LOH）等在肿瘤演进中存在随机的、个体化的特点，尚难以在其中找到共性的、适用于所有肿瘤或同类肿瘤的标志物，有其局限性的一面，相对而言，异常甲基化在肿瘤中属于普遍现象。可开发更为广泛适用的肿瘤生物学标志。
参考文献
[1] Jemal A, Bray F, Center MM，et al. Global http://sblunwen.com/jygc/ cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin,2011;61(2):69-90.
[2] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and MortalityWorldwide: IARC CancerBase No. 10. Lyon, France: International Agency forResearch on Cancer; Year. Available at: 2010. Last acce ssed2/27/2012.
[3] London WT, McGlynn KA. Liver cancer. In: Schottenfeld D, Fraumeni FJ Jr, eds [M].Cancer Epidemiology and Prevention. 3rded. New York: Oxford University Press;2006:763-786.
[4] Perz JF, Armstrong GL, Farrington LA, et al. The contributions of hepatitis B virus andhepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide [J]. JHepatol, 2006;45:529-538.
[5] Parkin DM. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002[J]. Int J Cancer, 2006;118:3030-3044.
[6] Dandri M, Burda MR, Bürkle A, et al. Increase in de novo HBV DNA integrations inresponse to oxidative DNA damage or inhibition of poly(ADP-ribosyl)ation [J].Hepatology, 2002;35(1):217-223.
[7] Ming L, Thorgeirsson SS, Gail MH, et al. Dominant role of hepatitis B virus andcofactor role of aflatoxin in hepatocarcinogenesisin Qidong, China [J]. Hepatology,2002;36:1214-1220.
[8] El-Serag HB. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in USA [J]. Hepatol Res,2007;37(suppl 2):S88-S94.
[9] Altekruse SF, McGlynn KA, Reichman ME. Hepatocellular carcinoma incidence,mortality, and survival trends in the United States from 1975 to 2005 [J]. J Clin Oncol,2009;27:1485-1491.
[10] Bosetti C, Levi F, Boffetta P, et al. Trends in mortality from hepatocellular carcinomain Europe,1980-2004 [J]. Hepatology, 2008;48:137-145.