第 1 章 绪论
1.1 研究背景
随着我国经济的快速发展，人民对美好生活的需求也越来越高，保障饮用水安全是最基本的民生，党的十九大报告指出持续提升饮用水水质是新时代的发展目标之一[1]。保证饮用水安全最基本的方式是对饮用水进行消毒, 杀死水中的致病微生物。为进一步提升饮用水水质，国内外众多学者对消毒方法进行了不断的探索和改进，从传统的氯消毒，到紫外线、臭氧等其他消毒方式的研究，再到联合消毒的应用以求达到更加高效、安全的消毒效果[2-3]。如表 1-1 所示，根据多项研究表明目前我国常用的消毒方法存在各自的优缺点，还没有一种既能保证消毒效率，又绝对健康安全，不产生消毒副产物的消毒技术。另外越来越多的研究发现氯、紫外线、臭氧等只能杀灭部分细菌，还有大量的细菌仅被损伤未完全死亡，这些细菌仍具有生理活性，一定条件下能够自我修复并且可能产生耐药性，这将给环境和人体带来潜在的危害[4]。
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1.2 国内外研究进展
1.2.1 茶多酚的性质及应用
茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶叶中一类具有生物活性的天然多酚类物质，平均相对分子质量为 281.36，成分复杂，存在多种异构体，主要的化学成分是儿茶素类化合物[16]。儿茶素类化合物由 8 种单体组成，分别是儿茶素(Catechin，C)、表儿茶素(Epicatechin，EC)、没食子儿茶素(Gallocatechin，GC)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin，EGC)、儿茶素没食子酸酯(Catechin gallate，CG)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate，ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(Gallocatechin gallate，GCG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)，其中 EGCG 所占比例最大，也是生物活性最强的[17]。
茶多酚本身呈白色粉末状，但是由于茶叶及提取工艺不同通常呈淡黄色、黄褐色或红褐色，无毒显酸性，碱性和光照条件下易发生氧化聚合[18]，可与蛋白质、多糖、核酸、金属离子等发生相互作用[19-22]。多项研究表明，茶多酚具有抗氧化、抑菌、防癌抗癌、抗病毒、抗辐射等生物活性，已在生物医药、食品保鲜、畜牧养殖等广泛应用[23]。
（1） 茶多酚在生物医药领域的应用
1.2.1 茶多酚的性质及应用
茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶叶中一类具有生物活性的天然多酚类物质，平均相对分子质量为 281.36，成分复杂，存在多种异构体，主要的化学成分是儿茶素类化合物[16]。儿茶素类化合物由 8 种单体组成，分别是儿茶素(Catechin，C)、表儿茶素(Epicatechin，EC)、没食子儿茶素(Gallocatechin，GC)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin，EGC)、儿茶素没食子酸酯(Catechin gallate，CG)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate，ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(Gallocatechin gallate，GCG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)，其中 EGCG 所占比例最大，也是生物活性最强的[17]。
茶多酚本身呈白色粉末状，但是由于茶叶及提取工艺不同通常呈淡黄色、黄褐色或红褐色，无毒显酸性，碱性和光照条件下易发生氧化聚合[18]，可与蛋白质、多糖、核酸、金属离子等发生相互作用[19-22]。多项研究表明，茶多酚具有抗氧化、抑菌、防癌抗癌、抗病毒、抗辐射等生物活性，已在生物医药、食品保鲜、畜牧养殖等广泛应用[23]。
（1） 茶多酚在生物医药领域的应用
由于茶多酚及 EGCG 对多种肿瘤细胞体内外增殖均具有明显的抑制作用，所以多与抗癌药物联合应用来增强抗癌效果并且降低抗癌药物的不良反应，例如有研究证实茶多酚与塞来昔布合用不仅可显著抑制乳腺癌细胞增殖还可减轻塞来昔布引起的胃肠道出血情况[24]。茶多酚有吸收放射性物质的能力，根据临床试验证明茶叶提取物可明显治疗化疗引起的辐射病，EGCG 可作为天然的辐射防护剂抵抗电离辐射诱导的损伤以及预防紫外线带来的皮肤损伤[25-26]。茶多酚具备良好的抗氧化性，可清除自由基，降低脂质过氧化，减少 DNA 氧化破坏，保护神经元细胞进而预防阿尔茨海默病等神经退行性疾病[27]。茶多酚可改变人体肠道菌群结构组成和功能，经过动物实验及临床试验已开始用于肥胖、高血糖、血脂异常和高血压等代谢综合征的干预治疗[28-29]。茶多酚具备良好的抗炎抗病毒作用，经研究表明可辅助治疗慢性乙型肝炎、流感等病毒性疾病[30-31]。
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第 2 章 试验材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 表没食子儿茶素没食子酸酯
试验选用表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为茶多酚抑菌特性的代表，EGCG购自于南京广润生物制品有限公司，由绿茶分离的儿茶素中提取，性状呈白色粉末状，纯度大于 98%，分子式为 C22H18O11，分子结构如图 2-1 所示，因其结构中有多个酚羟基所以具备较强的抗氧化活性，但一定条件下会产生促氧化作用。
2.1 试验材料
2.1.1 表没食子儿茶素没食子酸酯
试验选用表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为茶多酚抑菌特性的代表，EGCG购自于南京广润生物制品有限公司，由绿茶分离的儿茶素中提取，性状呈白色粉末状，纯度大于 98%，分子式为 C22H18O11，分子结构如图 2-1 所示，因其结构中有多个酚羟基所以具备较强的抗氧化活性，但一定条件下会产生促氧化作用。
2.1.2 大肠杆菌
选用大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）作为消毒效果及抑菌机制的作用对象，E.coli购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，生物危害程度是四类较为安全，由于购买的E.coli 是冻干状态，活性较低所以需复活培养后再进行后续试验。
选用大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）作为消毒效果及抑菌机制的作用对象，E.coli购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，生物危害程度是四类较为安全，由于购买的E.coli 是冻干状态，活性较低所以需复活培养后再进行后续试验。
2.1.3 培养基配置
试验选用营养肉汤培养基进行大肠杆菌的复活培养，营养肉汤培养基的配比是 1.8g营养肉汤粉加 100mL 的无菌蒸馏水。试验选用营养琼脂培养基和伊红美兰琼脂培养基进行大肠杆菌的计数和损伤率测定，营养琼脂培养基的配比是 3.3g 营养琼脂粉加 100mL无菌蒸馏水，伊红美兰琼脂培养基的配比是 4.25g 伊红美兰琼脂粉加 100mL 无菌蒸馏水。试验时根据实际用量按照配比进行各培养基的配置。
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2.2 试验方法
2.2.1 EGCG 浓度测定
试验采用酒石酸亚铁法检测 EGCG 的浓度变化，具体操作步骤如下：
(1) 配置酒石酸亚铁溶液：将 0.5g 的硫酸亚铁和 2.5g 的酒石酸钾钠混合，加入适量去离子水溶解后转移到 500mL 的容量瓶中继续用去离子水定容，摇匀后冷藏保存备用（最多保存 10 天）。
(2) 配制硼酸缓冲液：由于磷酸缓冲液会与试验中钙离子反应影响 EGCG 的试验结果，所以改进为应用硼酸缓冲液。先分别配制 0.05mol/L 的硼砂溶液和 0.2mol/L 的硼酸溶液，然后取 15mL 的硼砂溶液和 85mL 的硼酸溶液配制成 pH 为 7.6 的硼酸缓冲液，冷藏保存备用。
(3) 配制 EGCG 标准溶液。称取 0.1gEGCG 在烧杯中加蒸馏水溶解后，移至 100 mL容量瓶定容摇匀配置成 EGCG 原液，分别用移液枪吸取 1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5mL 原液到比色管中加水配置 200-1000mg/L 浓度梯度的标准溶液。
(4) 测定 EGCG 吸光度值。用移液枪吸取 5mL 配置好的酒石酸亚铁溶液和 15mL 的硼酸缓冲液加到比色管中摇匀，然后放入比色皿中利用 DR6000 紫外分光光度计检测在波长为 540nm 处的吸光度值，记录不同浓度下的吸光度值，结果如表 2-1 所示。
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试验选用营养肉汤培养基进行大肠杆菌的复活培养，营养肉汤培养基的配比是 1.8g营养肉汤粉加 100mL 的无菌蒸馏水。试验选用营养琼脂培养基和伊红美兰琼脂培养基进行大肠杆菌的计数和损伤率测定，营养琼脂培养基的配比是 3.3g 营养琼脂粉加 100mL无菌蒸馏水，伊红美兰琼脂培养基的配比是 4.25g 伊红美兰琼脂粉加 100mL 无菌蒸馏水。试验时根据实际用量按照配比进行各培养基的配置。
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2.2 试验方法
2.2.1 EGCG 浓度测定
试验采用酒石酸亚铁法检测 EGCG 的浓度变化，具体操作步骤如下：
(1) 配置酒石酸亚铁溶液：将 0.5g 的硫酸亚铁和 2.5g 的酒石酸钾钠混合，加入适量去离子水溶解后转移到 500mL 的容量瓶中继续用去离子水定容，摇匀后冷藏保存备用（最多保存 10 天）。
(2) 配制硼酸缓冲液：由于磷酸缓冲液会与试验中钙离子反应影响 EGCG 的试验结果，所以改进为应用硼酸缓冲液。先分别配制 0.05mol/L 的硼砂溶液和 0.2mol/L 的硼酸溶液，然后取 15mL 的硼砂溶液和 85mL 的硼酸溶液配制成 pH 为 7.6 的硼酸缓冲液，冷藏保存备用。
(3) 配制 EGCG 标准溶液。称取 0.1gEGCG 在烧杯中加蒸馏水溶解后，移至 100 mL容量瓶定容摇匀配置成 EGCG 原液，分别用移液枪吸取 1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5mL 原液到比色管中加水配置 200-1000mg/L 浓度梯度的标准溶液。
(4) 测定 EGCG 吸光度值。用移液枪吸取 5mL 配置好的酒石酸亚铁溶液和 15mL 的硼酸缓冲液加到比色管中摇匀，然后放入比色皿中利用 DR6000 紫外分光光度计检测在波长为 540nm 处的吸光度值，记录不同浓度下的吸光度值，结果如表 2-1 所示。
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第 3 章 Ca2+对 EGCG 抑菌能力的影响试验 ....................... 21
3.1 Ca2+对 EGCG 抑菌活性的影响 .................................... 21
3.1.1 EGCG 抑菌圈测定 ................................ 21
3.1.2 EGCG 最低抑菌浓度 .................................. 22
第 4 章 Ca2+环境下 EGCG 对大肠杆菌生命代谢特征的影响 ...................... 29
4.1 大肠杆菌细胞壁膜变化 .................................... 29
4.1.1 大肠杆菌细胞形态 ................................... 29
4.1.2 大肠杆菌细胞壁完整性 ........................... 30
第 5 章 Ca2+环境下 EGCG 对大肠杆菌的氧化损伤作用分析 ...................... 38
5.1 大肠杆菌内活性氧水平的变化 ............................... 38
5.1.1 大肠杆菌内超氧阴离子的变化 .............................. 38
5.1.2 大肠杆菌内羟基自由基的变化 .......................... 39
第 5 章 Ca2+环境下 EGCG 对大肠杆菌的氧化损伤作用分析
5.1 大肠杆菌内活性氧水平的变化
活性氧是生物体内一类氧的单电子还原产物，是氧气参与生命活动过程中生成的，主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基等。部分研究表明 EGCG 可能自氧化生成活性氧自由基氧化损伤大肠杆菌，本试验利用分光光度法检测超氧阴离子与羟基自由基的含量表征大肠杆菌内活性氧水平，进而分析 EGCG 和 Ca2+对大肠杆菌的氧化损伤。
5.1.1 大肠杆菌内超氧阴离子的变化
活性氧是生物体内一类氧的单电子还原产物，是氧气参与生命活动过程中生成的，主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基等。部分研究表明 EGCG 可能自氧化生成活性氧自由基氧化损伤大肠杆菌，本试验利用分光光度法检测超氧阴离子与羟基自由基的含量表征大肠杆菌内活性氧水平，进而分析 EGCG 和 Ca2+对大肠杆菌的氧化损伤。
5.1.1 大肠杆菌内超氧阴离子的变化
超氧阴离子（O2-·）是氧气参与生命活动的过程中最先产生的一种活性氧自由基，与细胞内很多生理活动相关，在正常的生理条件下细胞内超氧阴离子始终保持相对平衡的状态，但是当细胞受到外界刺激时会产生过量超氧阴离子，造成 DNA、蛋白质等生物大分子损伤从而导致细胞凋亡[109]。超氧阴离子与盐酸羟胺反应将生成 NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和 α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在 530nm 处有特征吸收峰，根据以上原理试验检测了不同处理条件下大肠杆菌内超氧阴离子的含量变化，以不添加药物的菌液为空白组，结果如图 5-1 所示。
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结论与展望
结论
本文为了探究饮用水中金属离子含量最高的 Ca2+对茶多酚消毒的影响，以 EGCG作为茶多酚抑菌性的代表，在宏观层面明确 Ca2+存在下 EGCG 的抑菌活性及消毒能力的影响，以及初步分析 Ca2+对 EGCG 结构性能的影响，由于低浓度 Ca2+与高浓度 Ca2+对 EGCG 的影响不同，故选取 1mM 的 Ca2+作为低浓度 Ca2+的代表，10mM 的 Ca2+作为高浓度 Ca2+的代表，进一步从微观层面探究 EGCG 和 Ca2+对大肠杆菌细胞微观结构、呼吸代谢及氧化损伤的影响，分析 Ca2+对 EGCG 抑菌作用的影响机制与此同时进一步完善了 EGCG 对大肠杆菌氧化损伤的机制，具体结论如下：
（1）低浓度 Ca2+（1-5mM）会降低 EGCG 的抑菌活性，高浓度 Ca2+（6-10mM）对 EGCG 的抑菌性则有一定的促进作用。无钙离子存在下 EGCG 的最低抑菌浓度为2mM，低浓度 Ca2+对于 EGCG 的最低抑菌浓度无明显影响，高浓度 Ca2+时则降至 1.5mM，表明高浓度 Ca2+可能降低 EGCG 剂量，有利于发挥 EGCG 的抑菌作用。高浓度 Ca2+条件下 EGCG 对大肠杆菌的生长抑制效果较强，可提高 EGCG 对大肠杆菌的杀灭能力，但是高浓度 Ca2+会致使 EGCG 衰减速率加快，可能影响 EGCG 对细菌灭活的程度进而出现细菌复苏现象。
（2）EGCG 与 Ca2+在自然条件下络合作用不明显，无出现络合产物，说明 Ca2+对EGCG 抑菌性能的影响并不是因为络合作用。在无菌条件下溶液状态的 EGCG 易解离进而结构发生变化，但是在高浓度钙溶液中酚羟基下降幅度很小，说明高浓度的 Ca2+环境下 EGCG 更易发挥抑菌作用。另外高浓度 Ca2+环境下大肠杆菌内 ATP 消耗明显受到阻碍，说明高浓度 Ca2+对 EGCG 抑菌作用有促进作用可能是因为抑制了大肠杆菌的能量代谢。
参考文献（略）
结论
本文为了探究饮用水中金属离子含量最高的 Ca2+对茶多酚消毒的影响，以 EGCG作为茶多酚抑菌性的代表，在宏观层面明确 Ca2+存在下 EGCG 的抑菌活性及消毒能力的影响，以及初步分析 Ca2+对 EGCG 结构性能的影响，由于低浓度 Ca2+与高浓度 Ca2+对 EGCG 的影响不同，故选取 1mM 的 Ca2+作为低浓度 Ca2+的代表，10mM 的 Ca2+作为高浓度 Ca2+的代表，进一步从微观层面探究 EGCG 和 Ca2+对大肠杆菌细胞微观结构、呼吸代谢及氧化损伤的影响，分析 Ca2+对 EGCG 抑菌作用的影响机制与此同时进一步完善了 EGCG 对大肠杆菌氧化损伤的机制，具体结论如下：
（1）低浓度 Ca2+（1-5mM）会降低 EGCG 的抑菌活性，高浓度 Ca2+（6-10mM）对 EGCG 的抑菌性则有一定的促进作用。无钙离子存在下 EGCG 的最低抑菌浓度为2mM，低浓度 Ca2+对于 EGCG 的最低抑菌浓度无明显影响，高浓度 Ca2+时则降至 1.5mM，表明高浓度 Ca2+可能降低 EGCG 剂量，有利于发挥 EGCG 的抑菌作用。高浓度 Ca2+条件下 EGCG 对大肠杆菌的生长抑制效果较强，可提高 EGCG 对大肠杆菌的杀灭能力，但是高浓度 Ca2+会致使 EGCG 衰减速率加快，可能影响 EGCG 对细菌灭活的程度进而出现细菌复苏现象。
（2）EGCG 与 Ca2+在自然条件下络合作用不明显，无出现络合产物，说明 Ca2+对EGCG 抑菌性能的影响并不是因为络合作用。在无菌条件下溶液状态的 EGCG 易解离进而结构发生变化，但是在高浓度钙溶液中酚羟基下降幅度很小，说明高浓度的 Ca2+环境下 EGCG 更易发挥抑菌作用。另外高浓度 Ca2+环境下大肠杆菌内 ATP 消耗明显受到阻碍，说明高浓度 Ca2+对 EGCG 抑菌作用有促进作用可能是因为抑制了大肠杆菌的能量代谢。
参考文献（略）