医学毕业论文范文：对比两种剂型亚甲基蓝光敏剂介导的光能源疗法对粪肠球菌沾染的抗菌效应

前言

随着牙髓医治理念和技巧的进步，根管医治的胜利率较以往显著进步，但临床上仍存在局部医治失败病例[1]。引起根管医治失败的起因较多，其中细菌沾染占主导因素[2]。而 E. faecalis 是目前公认的引起根管医治失败的重要致病菌之一[3]。E. faecalis 作为再医治根管中检出率较高的病原菌，不只具备侵入牙实质小管的才能[4]，且能在养分物资缺少、高碱性及抗菌药物存在的恶劣环境中生活并造成再沾染[5-7]，如何有效去除根管内 E. faecalis 沾染已成为临床医治胜利的症结。机械准备配合化学消毒是根管医治术的一个重要环节，该方式可以有效去除根管内绝大局部沾染物资，在掌握根管沾染方面充任重要角色[8]。受根管解剖特征影响，其在抗衡隐匿部位（如牙实质小管深层，侧支根管、副根管等）沾染菌时仍存在肯定局限性。
次氯酸钠（NaOCl）溶液和氢氧化钙糊剂是临床常用根管消毒药物。研究证明，在一定范围内 NaOCl 溶液的抗菌效果随着药物浓度的升高逐渐增强[9]，然其细胞毒性亦随浓度的升高而增加[10]，且NaOCl 溶液的表面张力限制了药物在根管系统狭窄部位特别是牙本质小管内的扩散和清理能力[11]。另外，无论是体外还是体内研究，E. faecalis 均对常用的根管消毒药物氢氧化钙具有较强的耐受性，即使延长该药物的作用时间，也难以彻底清除牙本质小管内的感染物质[12]。正是由于 E. faecalis 对常规机械预备及化学消毒药物的感受性不强，因而残存的细菌可在根管内长期存活，并在条件允许时形成根管内的再感染，临床上常表现为难治性根尖周炎，如多次根管治疗仍难以控制的再感染及根尖周炎症的迁延不愈[13]。因此，探索一种安全、有效的辅助根管消毒的新方法对于提高临床难治性根尖周炎治疗成功率及预后具有重要意义。PDT 作为目前国际上正在发展的一门交叉学科，有关其抗微生物感染的报道最早源于上个世纪初期[14]，但由于上世纪中期抗生素的发现使得其逐渐被遗忘。近年来，抗生素的大量使用导致耐药菌的广泛流行，并出现一些多重耐药菌。
因此，寻找一种新的抗感染策略刻不容缓。PDT 凭借其有效、安全、毒副作用小、可重复使用等优点[15]，在众多抗感染策略中脱颖而出，且随着越来越多光敏剂的研发及实验条件的改善，PDT 在口腔医学研究领域中也取得较大进展，并显现出广阔的应用前景。PDT 的抗菌机制主要是光敏剂在光源激活下，与氧分子作用产生活性氧簇（Reactive Oxygen Species, ROS），作用于靶细胞，从而引起细菌的裂解、死亡[16]。其基本要素主要由光源、光敏剂和氧三者组成，其中光敏剂是 PDT 的核心物质。
PDT 的蓬勃发展势必带来其关键部分-光敏剂的研发高潮。近年来，随着科学的发展，光敏剂的开发合成也经历了几代改革。以血卟啉为代表的第一代光敏剂由于其最大吸收波长不在对人体组织透过率较佳的红光区，药效不尽理想，且皮肤光毒性大等缺陷，临床应用受到限制[17,18]。第二代光敏剂是在 20 世纪 80 年代以后研究发展起来的，它们的组成和结构明确，在光敏活性、吸收光谱和组织选择性等方面与第一代光敏剂相比，都有很大改进[19]。第二代光敏剂部分地克服了第一代光敏剂的组分复杂，对组织选择性和光动力损伤强度的稳定性都很差的缺点[20]。其主要优点为光敏期短，作用的光波波长较长，因而可增加作用深度，产生的单态氧也较多，对靶细胞更具选择性[21]。
目前，PDT 在对抗口腔微生物感染时，多选用以甲苯胺蓝 O（Toluidine BlueO, TBO）或亚甲基蓝（Methylene Blue, MB）为代表的第二代光敏剂。二者均属于吩噻嗪类碱性染料，与细胞核内的 DNA 及细胞浆内的 RNA 有较强的亲和力[22]。研究发现，细菌、酵母菌和原生生物等病原体对吩噻嗪类染料具有易感性，因此，此类染料可应用于光动力抗微生物治疗[23]。目前，TBO 介导的 PDT 已开始进入体内研究阶段，并取得较好治疗效果[24-26]。而有关 MB 的报道仍主要局限于体外探索阶段。
实际上，MB 在医学领域的研究范围较为广泛，且历史久远。早在上个世纪三十年代就有关于 MB 对抗噬菌体和病毒感染的报道[27]。MB 除了具有疾病治疗作用外，还具有疾病诊断价值。Creagh 等[28]认为，高浓度 MB 可用于诊断膀胱癌，且不引起宿主细胞毒性反应。MB 的高疾病诊断和治疗价值，使其备受研究者特别是口腔科研工作者的青睐。作为一种亲水性光敏剂，MB 已被证明能够有效对抗 G+菌和 G-菌[29]。但现有的体外研究表明，其介导的 PDT 在对抗根管感染菌时虽可取得显著疗效，却仍不能达到完全灭菌的效果。事实上，光敏剂类型的选择对根管消毒疗效的影响至关重要。理想的光敏剂要求表面张力低，可渗入牙本质小管深处，只在光照时体现局部毒性，且对微生物的杀伤具有高度选择性[30]。MB 物理特性中一个很重要的研究内容是其在水溶液中的聚合状态[31]。
水剂型 MB 与细菌作用时，容易聚集于菌体表面产生二聚体，而二聚体的形成直接影响 ROS 的生成量，因而降低了 MB 的光敏效应。为此，学者们开始对其剂型加以改良，形成了光敏效应更强、更稳定的混合剂型 MB，该剂型含有的有机成分（甘油、酒精）能阻止光敏剂发生聚合，使其可直接作用于靶细菌的 DNA 中[32]。另外，混合剂型 MB 在牙本质小管内的渗透范围更深[33]，因此光敏效应也随之增强。
目前，有关水剂型 MB 及混合剂型 MB 介导的 PDT 对抗根管 E. faecalis 感染的研究国内尚未见相关报道。理论上，由于混合剂型 MB 在光物理性能上的改良，其抗菌效应优于水剂型 MB，但实际上两种不同剂型 MB 用于根管消毒时二者的抗菌效应孰优孰劣尚不能定论，因此有必要通过一系列实验加以比较研究。考虑到 PDT 在进入临床应用前必须首先满足两方面内容即：不仅要有高效抗菌、抑菌作用，还应有良好的生物安全性。
为此，本研究拟选取 hPDLFs 作为毒性检测细胞，通过体外实验首先观察两种剂型 MB 介导的 PDT 对 hPDLFs 的毒性作用，考察该疗法在根管消毒时的生物安全性。再利用菌落计数法检测 PDT 对浮游状态 E. faecalis 的抗菌效应，旨在探索该细菌对 PDT 的敏感性，为后期根管感染模型中细菌生物膜的研究奠定实验基础，并提供相应数据参考。同时，在研究两种剂型 MB 介导的 PDT 对根管内 E.faecalis 生物膜的抗菌效应之前本研究亦观察比较了不同光照方式对 PDT 效应的影响，进一步分析了影响 PDT 抗菌效应的相关因素并为后期实验奠定技术基础及理论依据。

目录
前言………………………………………………………………………… 10
实验一、两种剂型亚甲基蓝光动力疗法对人牙周膜成纤维细胞的体外毒性研究…………………13
实验二、两种剂型亚甲基蓝光动力疗法对粪肠球菌的体外抗菌研究………………………………22
实验三、不同光照方式介导的光动力疗法对牛牙粪肠球菌根………………………………………29
实验四、两种剂型亚甲基蓝光动力疗法对牛牙粪肠球菌根管感……………………………………38
全文小结…………………………………………………………48

小结
比较两种剂型亚甲基蓝光敏剂介导的光动力疗法对粪肠球菌感染的抗菌效应，PDT 抗菌作用越来越受到重视，本研究以水剂型 MB 和混合剂型 MB 为光敏剂，不仅体外观察其对 hPDLFs 的毒性作用，还通过菌落计数法和 SEM 技术研究 PDT 对浮游状态 E.faecalis 及根管感染模型中细菌生物膜的抗菌性能，初步探讨了 PDT 用于根管消毒的安全性和可行性。同时，本研究还观察比较了两种不同剂型MB 介导的 PDT，以及不同光照方式介导的 PDT 的抗菌效应，从而分析影响 PDT 疗效的相关因素。研究结果如下：
1. 当浓度≤ 25 μmol/L 时，两种剂型 MB 介导的 PDT 对体外培养的 hPDLFs的毒性作用较小；浓度≥50 μmol/L 时，可观察到细胞发生明显形态学改变，提示该浓度范围内的光敏剂对细胞影响较大。
2. 光敏剂浓度为 100 μmol/L 时，两种剂型 MB 介导的 PDT 对浮游状态 E.faecalis 均具有明显杀伤作用，单独光照和单独光敏剂处理对细菌杀伤作用较弱，提示只有光源和光敏剂联合作用，方能使PDT 发挥最佳效应。
3. 光导纤维置于根管口照射和根管内照射均能使根管内 E. faecalis 产生明显杀伤作用。提示对于直根管的治疗，PDT 抗菌效应不受光导纤维在根管内的位置影响，只要参数合适，均能使 PDT 发挥理想疗效。
4. 菌落计数法和 SEM 观察结果显示：超声冲洗联合 PDT 处理对根管内 E.faecalis 感染的抗菌效应最明显，单独 PDT 处理抗菌率低于单独超声冲洗，提示PDT 今后应用于临床根管消毒时，仍需配合超声冲洗方能达到最佳抗菌效应。

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