第一章 引言
1.1 中性蛋白酶基因克隆、表达的研究现状
蛋白酶是一大类能催化蛋白质中肽键的断裂产生游离氨基酸、小肽或肽段的酶的总称，亦称为蛋白水解酶 (ProtelyticEnzymes)，与脂肪酶、淀粉酶、果胶酶并为工业用四大酶类。由酶作用于肽链的位置分类，可将蛋白酶通分为内肽酶(endopeptidases)和外肽酶(exopeptidases)。内肽酶亦称为蛋白酶(Proteinase)，其优先作用位置在远离 N—端或 C—端的肽链内部区域，酶的活性受自由氨基或羧基的基团影响。内肽酶是从内部切断蛋白质分子而外肽酶则是从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，从而使氨基酸游离，前者为氨基肽酶后者则是羧基肽酶。工业
生产中常用的蛋白酶，主要是内肽酶。动物内脏、植物茎叶、果实以及微生物中都有蛋白酶存在。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌产生。蛋白酶因其自身作用、结构及特性的多样性，往往不能用国际生物化学联合会统一使用的学名进行表示，通常还有常用名。如根据酶作用底物或产生蛋白酶的组织把水解胶原蛋白的蛋白酶称为胶原蛋白酶，把胰脏产生的蛋白酶叫做胰蛋白酶等；根据酶的最适催化温度，可分为低温蛋白酶、中温蛋白酶、高温蛋白酶；按酶的活性中心和最适 pH 值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶；按其反应的最适 pH 值，又分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。中性蛋白酶（bacillolysin）是枯草芽孢杆菌分泌的一类主要胞外多肽内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、PH 值下，能把大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的 HAP 和 HVP，此外还可用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工。
1.1.2 中性蛋白酶的应用
酶的应用已有千年以上的历史，虽然中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，但是广泛应用还是最近几十年的事。随着科学技术的迅猛发展以及酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也不断扩大。自上世纪以来，世界各国科研工作者一直都在致力于中性蛋白酶产生菌的筛选、酶的提取、纯化以及酶学性质的研究和应用研究工作，并取得了一定的成绩。中性蛋白酶的应用主要分为以下几个方面： 在食品工业中的应用面粉是焙烤加工工艺中一个重要的原料，研究发现，由于陈面粉酶活力低、发酵力低，因而用陈面粉制造的面包体积小、色泽差。往陈面粉中添加中性蛋白酶，不但可以提高面包质量，还有利于减小混合时间和增加面包的起泡性，细菌中性蛋白酶可用于提升面团的延伸性和韧性。真菌源的中性蛋白酶和碱性蛋白酶在豆酱的加工过程中起着极其重要的作用，在大豆蛋白中加入真菌源的中性蛋白酶可以使产量提高 20%-30%。大豆酶解产物的苦味极大地限制了其在食品和健康营养品的应用范围，其苦味强度与疏水氨基酸的量和肽链中心的脯氨酸残基有一定的关系。
肽酶能水解疏水性的氨基酸以及脯氨酸，可以将它用于苦味肽的脱苦，并且通过内肽酶的限制性水解与氨肽酶的协同作用也能降低产物的苦味。中性蛋白酶亦广泛应用于啤酒及茶饮料的澄清等加工工艺过程中，中性蛋白酶在茶浸出液膜分离中的应用，特别的是其在红茶中的应用有着广泛的市场前景。在啤酒巴氏消毒前，加入中性蛋白酶处理啤酒，可以防止啤酒浑浊，延长啤酒保存时间。另外，中性蛋白酶还能用于肉类嫩化，主要是因其能将肌原纤维与弹性蛋白溶解从而变成无规则的结构。
第二章 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶 npr 基因的克隆和表达
2.1 引言
中性蛋白酶是枯草芽孢杆菌分泌的一类主要胞外多肽内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。随着科学技术的迅猛发展以及酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也不断扩大。本实验选用广州微生物研究所的中性蛋白酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS1.382 为研究对象，提取总 DNA，通过 PCR 方法，克隆出中性蛋白酶基因并在大肠杆菌中成功表达，获得了具有一定活性的中性蛋白酶，为中性蛋白酶的基因工程提供了理论基础，并为该酶的高效表达及应用奠定了基础。
2.2 试验材料
2.2.1 材料
枯草芽孢杆菌 AS1.382：购自广东省微生物研究所菌种保藏中心；基因表达菌 E.coli BL21(DE3)：由本试验室保存；克隆宿主菌：E.coli JM109 实验室自制克隆载体：pGM-T Vector 天根生化科技有限公司，北京；表达载体：pET-22b(+) 由本试验室保存。
2.2.2 主要仪器
各种规格移液器 中国大龙；Gene Amp PCR System 9600 型 PCR 扩增仪 PE 公司产品；高速冷冻离心机 日本 KUBOTA 产品；-70℃超低温冰箱 SANYO 公司产品；电泳仪、电泳槽 北京六一仪器厂；高速台式离心机（TGL 16G） 上海医用分析仪器厂；恒温振荡器（TH2-82 型） 上海跃进医疗器械厂；恒温水浴箱 丹东市医疗器械厂；恒温培养箱 上海跃进仪器厂；4℃冷藏冰箱 海尔公司产品；-20℃冷冻冰柜 海尔公司产品；凝胶成像分析仪 UVP 公司产品；电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；PHS-3C 型精密 PH 计 上海雷磁仪器厂；超净工作台 哈尔滨东联电子技术开发公司；DRP-9272 型电热恒温培养箱 上海深信实验仪器有限公司；
第三章 中性蛋白酶改善大豆分离蛋白乳化性.................................... 36-48
3.1 引言................................... 36
3.2 试验材料 ...................................36-37
3.3 试验方法................................... 37
3.4 结果与分析................................... 37-47
3.5 小结与讨论................................... 47-48
第四章 乳化性大豆分离蛋白改善冰淇淋品质................................... 48-55
4.1 引言 ...................................48
4.2 试验材料................................... 48-49
4.3 试验方法 ...................................49-51
4.4 结果与分析................................... 51-54
4.4.1 单因素结果 ...................................51-52
4.4.2 冰淇淋各评价指标的测定 ...................................52-54
4.5 小结与讨论................................... 54-55
第五章 结论与建议 ...................................55-56
5.1 结论................................... 55
5.2 创新点................................... 55
5.3 建议................................... 55-56
结论
实验采用基因工程技术构建产中性蛋白酶的基因工程菌株，通过其产生的中性蛋白酶对大豆分离蛋白进行改性，系统研究了改性的工艺条件对大豆分离蛋白乳化性的影响，并对其在冰淇淋中的应用进行了深入探讨，主要研究结论如下：试验以 Bacillus subtilis 基因组 DNA 为模板，根据 nprE 基因序列设计、合成引物，利用 PCR 技术扩增得到中性基因，克隆到载体 pGM-T 中进行酶切和测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒进行酶切、连接，构建重组表达质粒 pET-npr，将重组表达质粒 pET-npr 转入大肠杆菌 BL21（DE3）中，成功地构建产中性蛋白酶的菌株，并对重组菌进行诱导表达。测定所得中性蛋白酶的酶活，酶活为 257.63U/mL。
以大豆分离蛋白乳化性为指标，通过单因素试验确定 pH、大豆分离蛋白质量分数、酶用量、反应温度和反应时间对改性 SPI 乳化性能的影响，确定各因素的最适范围，在单因素的基础上，利用 SAS8.2统计分析软件对试验数据进行处理分析，同时，得到大豆分离蛋白的最佳改性工艺参数为：pH 为 7.1、大豆分离蛋白质量分数为 5.6%、酶用量为 5000 U/mL、反应温度为 51℃、反应时间为 117min，该条件下得到改性后大豆分离蛋白的乳化活性为 1.390，乳化稳定性为 135.67min。
两种功能性分别提高了 2.125倍和 2.146 倍。探讨未改性大豆分离蛋白和改性大豆分离蛋白部分替代奶粉对冰淇淋品质的影响。实验结果表明，当改性后大豆分离蛋白替代率为 5%，冰淇淋的粘度，膨胀率和感官品质均达到最高，而融化率最低，此条件下制作冰淇淋最为优良。