1文献综述
1.1拷贝数变异（CNVs)研究现状
拷贝数变异（Copy Number Variations, CNVs)，是指基因组中从几kb到几Mb范围内的DNA片段的结构变异，其中包括：缺失（丟失一个或两个拷贝）、重复(获得一个或多个拷贝）、倒位（一个染色体区段的翻转）和易位（一个片段从一个染色体转移到另一个染色体)'"。拷贝数变异首先是在对果蝇的Bar基因研究中发现的，之后研究认为可通过对基因的扰乱和基因含量的改变来影响基因的表达从而引起表型的改变并导致疾病的发生。让人更为惊讶的是，拷贝数变异也同样大量存在与正常个体的基因组中
1.2.1现与参考基因组相比
DNA片段的拷贝数变异可使个体间DNA序列差异达到10%"'"。 Sebat等通过对20个正常个体基因组的检测，发现了 76个具有特异性的CNVs遗传标记，从而看到了 70个基因的拷贝数变异多态性；Sharp"'等通过对7个不同群体（包括47个正常个体）的研究，也发现了 119个具有多态性的CNVs遗传标记。
.近年来，CNVs已成为人类和其他哺乳动物遗传变异研究的一个热点，而且随着研究的深入，目前已发现CNVs与很多人类疾病具有非常密切的关系。2006年由Redon"'等公布的人类基因组第一代CNVs图谱涵盖了 1447个CNVs区域，包含了成百上千的疾病位点等。在CNVs与精神分裂症的相关性研究I"中，研究者发现精神分裂症患者的基因组中，1号和15号染色体上拷贝数变异有很高的频率，在正常人基因组中则很难发现。此外，与SNP不同的是，CNV大片段可影响相邻多个基因而引起缺损从而导致复杂疾病，如CNVs能增加HIV-1感染以及肾小球肾炎'的患病风险，且其与很多疾病有较强关联性，如帕金森病。在植物研究中，基因拷贝数变异的研究主要集中在利用转基因技术以及工程菌外源基因表达技术改变功能基因的拷贝数进而提高有效成分的含量。
在代谢途径工程的研究中，通过基因拷贝数变异提高路类化合物产量的应用研究已有较大进步，主要是利用DNA重组技术从基因水平上人工调控产物合成过程。Jin-WookSeo'i"等通过根癌农杆菌介导，在刺五加中增加了鲨烯合酶基因的拷贝数，从而提高了甾醇和三薛类产物的产量。孔建强等通过增加酿酒酵母中HMGR和FPPS基因的拷贝数，使得酵母工程菌中紫穗槐-4, 11-二烯产量显著增加。按照中心法则，理论上拷贝数的增加应该增加表达产物的产量，但是也有研究发现拷贝数增加有时并不会对产物产量产生影响，有时候甚至会产生负面影响。在Masferrer"3i等人及Besumbes等人的转基因拟南芥研究中，转基因植物出现了生长阻滞、早衰等现象。而李兵等利用毕赤酵母表达纤维素晦基因时发现不同拷贝数酵活表达参数不同，且低拷贝重组菌有相对较好的纤维素酵的表达量。此外，井申荣''"等通过构建多拷贝表达盒利用毕赤酵母表达白细胞介素-10 ( (IL-10),结果8拷贝表达盒重组载体转化子分泌表达水平最高，这说明拷贝数增加可以提髙目的蛋白表达量，但并不是线性增加，这可能与基因沉默有关。这些都说明，基因拷贝数的变化，对人体、植株乃至宿主菌都会有重大影响。
1.2甘草酸生物合成途径研究进展
本实验室沈湛云""、刘东吉''"等已对甘草酸生物合成途经的前期研究进行了综述，'具体可参见北京中医药大学硕士论文。在近几年的研究中，研究者又发现了两个与甘草酸生物合成途径中e-香树脂醇后续氧化过程相关的新基因，为甘草酸生物合成的进一步研究提供了新方向。2008年Hikaru Seki'"'等的研究发现细胞色素P450单氧化酶基因CYP88D6的表达产物可催化P-香树脂醇的C-11位的氧化；2011年Hikaru Seki"等的研究发现细胞色素P450氧化睥基因CYP72A154的表达产物可催化11-氧化-香树脂醇的C-30位的氧化。
2研究思路与方法
2.1研究目标
本课题拟构建分别含有甘草HMGR、 SQS和B-AS基因不同拷贝数的工程菌，检测其对基因表达的影响，从mRNA水平揭示功能基因拷贝数变异对嗨的影响，为深入研究功能基因CNVs对甘草酸含量的影响提供依据，为研究甘草酸含量差异的分子机制奠定基础。
2.2研究内容
2.2.1甘草
HMGR、 SQS和IJ-AS基因的毕赤酵母表达载体的构建采用已含有甘草HMGR、 SQS和P-AS基因的大肠杆菌重组质粒为模板，经PCR获得带有蹄切位点的基因片段，双酵切后与表达载体连接，分别构建毕赤酵母表达载体。
2.2.2含有甘草
HMGR、 SQS和(J-AS基因菌株的拷贝数变异筛选将表达载体转化到毕赤酵母中，进行转化子分析、遗传霉素抗性转化子初筛(G418筛选）和Mut+表型筛选，并进行PCR快速鉴定和诱导表达检测基因的插入，然后提取DM,釆用实时荧光定量PCR技术准确测定各菌株拷贝数。
第三章 基因的工程菌的构建................................. 40-54
3.1 实验材料、试剂及仪器................................. 40
3.2 溶液及培养基配制 .................................40-42
3.3 实验方法 .................................42-47
3.4 实验结果................................. 47-52
3.5 小结与讨论................................. 52-54
第四章 Real time PCR体系的建立.................................54-70
4.1 实验材料、试剂及仪器 .................................54
4.2 实验方法................................. 54-60
4.3 实验结果 .................................60-67
4.4 小结与讨论 .................................67-70
第五章毕赤酵母的基因表达分析 .................................70-80
5.1 实验材料、试剂及仪器................................. 70
5.2 溶液及培养基配制 .................................70-71
5.3 实验方法................................. 71-73
5.4 实验结果 .................................73-79
5.5 结果与讨论 .................................79-80
结论
本文通过创造甘草关键酶基因HMGR、 SQS和e-AS的拷贝数变异，检测了基因拷贝数变异对其表达的影响，为研究甘草酸含量差异的作用机制奠定基础。
(1) 成功构建了甘草HMGR、 SQS和P-AS基因的毕赤酵母表达载体，为其他真核表达研究?提供参考；
(2) 建立了 Real time PCR体系，并通过标准曲线的建立检测到不同菌株中插入的甘草基因的拷贝数；
(3) 实现了甘草HMGR、 SQS和P-AS基因在毕赤酵母中的拷贝数变异，获得了很多带有甘草基因不同拷贝数的毕赤酵母菌株；对甘草三个基因的拷贝数变异检测中，HMGR基因和SQS基因拷贝数多态性分布广泛，P-AS基因的插入均为单拷贝，未检测到拷贝数变异；
(4) RT-PCR测定基因表达量结果：HMGR基因不同拷贝数插入时基因表达量差异明显，且4拷贝插入时表达量最高，44拷贝时表达量最低，最高为最低的3倍，说明HMGR基因CNVs可对其表达产生影响；SQS基因不同拷贝数插入时基因表达量无显著差异，说明SQS基因CNVs并未对其表达产生影响。