第一章绪论
1.1课题提出背景及研究内容
水是人类生态环境的重要组成部分，同时也是人类赖以生存的主要自然资源之一。随着全球经济社会的迅速发展，由于人为的原因，重金属通过冶炼加工金属、开采矿山、滥用农药化肥、排放化工废水、弃置生括垃圾等人为的活动使重金属进入了水中，严重污染了水体环境，特别是近年来电镀业、制革业、防腐业等工业的迅猛发展，使用重金属范围更广，不仅仅出现了重金属资源相对缺乏的局面，而且严重的污染了生态环境中的水体目前，我国己经将铅、铜、镍、镉、铬、汞等9种重金属列入了水中需要优先控制的68种污染物的"黑名单"。
重金属在进入生态环境以后不容易被生物所降解，反而容易被水生生物吸附、进而富集参与到食物链的循环，最终积累在生物体内，破坏了生物体正常的生理代谢活动，对生态环境和人体健康造成严重威胁。
1.1.2课题研究现状
目前，传统的处理重金属废水的方法主要有以下三种：物理处理法，化学处理法和生物处理法。传统的物理化学处理法主要包括有沉淀法，电化学法、螯合树脂法、电解法、高分子捕集剂法、天然沸石吸附法、活性炭吸附工艺、氧化还原法、离子交换法等，他们具有处理净化的效率较高、周期较短等优点，同时也有各自不同的缺点，如螯合树脂因其毒性检验问题，无法使其在食品工业和饮用水处理中广泛使用；膜处理法的选择性比较小，处理后废水浓度较高，反应膜也难以重复使用，使用效率比较低；同时这些传统的处理方法大多处理流程长、操作比较麻烦、处理费用较高。此外处理条件比较苛刻、成本较高、产生废渣比较多、引入难以解决的二次污染、处理量有限制等缺点。因此，需要广大学者研究开发新的处理方法，解决这些水处理问题，随之生物吸附技术应运而生。
与传统的处理方法相比，生物吸附技术由于其广阔的应用前景和较好的应用环境和社会效益引起了人们的注意。然而从自然界中直接篩选出的微生物往往对目标重金属的选项性不是很高，富集效率不高，环境适应能力也较差，同时还不能够高效的回收利用重金属资源，不利于工程的实际应用。近年来，随着分子生物技术的飞速发展，人们已能利用生物技术按自己的意愿改造微生物，选育高性能菌株。运用基因工程技术构建选择性高、富集能力强的基因重组微生物，成为了生物处理重金属废水和合理利用重金属资源的关键技术。
1.1.3重金属废水的性质
一般来说，重金属指的是密度在5g/cm3以上的金属.而环境污染方面所说的重金属，主要是指生物毒性显著的重金属如汞、镉、铅、铬、类金属砷等,还包括具有一定毒性的重金属如锌、铜、钴、镍、锡钒等。
第二章基因工程菌的耐受性
2.1实验材料及其器材
蛋白胨；酵母提取物；固体NACL;去离子水；基因工程菌；NaOH溶液
2.1.2主要仪器设备及用途
实验仪器及其生产厂家如表2-1所示。
2.1.3 LB培养基的配置
(1) 称取NACL固体1.0 g，蛋白胨1.0 g,酵母提取物0.5 g于250 mL的烧杯中，力口lOOmL的蒸馏水，充分搅拌溶解，12rC灭菌20 min后，滴加2M NaOH溶液调pH至3-11 ，每隔0.5调一次PH，共16种不同pH值的LB液体培养基。4摄氏度的温度中保存。
(2) 利用水浴恒温振荡器，将同样pH值（ph约为6. 5)调至温度为lot：、 15°C、 2CrC、25°C、 4(rC、 45°C、 5(rC七种不同温度的LB液体培养基。
2.2.1基因工程菌生长环境的制备
(1) 取冻存于-7(rC冰箱中的金属硫蛋白菌，按照1 %的接种量划线接种于LB液体培养基平板上，37'C震荡培养过夜。从平板中挑取单菌落，接种于16种不同PH值的LB液体培养基中，37°C恒温振荡器225 r/min振摇培养过夜。
(2) 取冻存于-70°C冰箱中的金属硫蛋白菌，按照1 %的接种量划线接种于LB液体培养基平板上，37°C震荡培养过夜。从平板中挑取单菌落，接种与7种相同PH值的LB液体培养基。将接种好工程菌的LB培养基放入水浴恒温振荡器，相同速度225 r/min但不同温度震荡培养过夜。
(3) 每一种组实验的LB培养基都需要配置一种标准培养基溶液，用于通过核酸检测的标准曲线的制作，做空白对比。
第三章 金属硫蛋白基因工程菌的静态试验........................................... 36-60
3.1 实验材料与装置........................................... 36-38
3.2 实验方法........................................... 38
3.3 实验装置图........................................... 38-39
3.4 结果与分析........................................... 39-50
3.5 其他综合结论 ...........................................50-56
3.6 正交试验........................................... 56-59
3.7 本章小结........................................... 59-60
第四章 金属硫蛋白基因工程菌的动态试验........................................... 60-84
4.1 实验材料与装置........................................... 60
4.2 实验反应装置图........................................... 60-61
4.3 实验方法........................................... 61-62
4.4 结果与分析 ...........................................62-78
4.5 电镜实验 ...........................................78-82
4.6 本章小结........................................... 82-84
第五章结论及对今后工作的建议........................................... 84-88
5.1 论文的主要结论........................................... 84-85
5.2 对今后工作的建议........................................... 85-88
结论
本文在前人工作的基础上，将重金属的耐受性基因通过基因工程技术转入微生物并成功表达，增强了微生物对重金属的结合能力，高效率的实现了生物回收重金属和治理重金属污染。本论文主要研究了基因工程菌对温度以及PH的耐受性，考察了基因工程菌在静态和动态两种不同模拟下，不同的参数条件下对Cd2 Cr". Ni2去除效果以及微生物在填料表面的富集状态。主要的研究结论：
(1) 重金属的耐受范围实验通过构建基因工程菌在不同LB液体培养生长条件中，长时间的培养，利用现代仪器分析技术科学地检测出pGEX-ZjMT-B确切的耐受性范围，得出了结论：
①该金属硫蛋白基因工程菌对pH的耐受范围相当广，从pH=4.5到pH=lld的范围内都可以很好的生长，完全符合实际工程工业废水处理工程的需要。
② 该金属硫蛋白基因工程菌对温度的耐受范围相对比较窄，20°C-45°C才能正常生长，则实际工业废水工程中为了达到更好的处理效果，还需要综合考虑温度的影响因素。
(2) 静态实验条件下实验室通过人为的构建了静态处理重金属模拟废水的水处理工艺，结合上一章节微生物的温度、PH耐受范围的研究结果，通过改变不同的试验参数，如活性炭、陶粒、阿科曼及芯炭四种不同填料，4、 7、 9、 11四种不同的PH值，以及25°C、 37°C、 45°C等不同温度下等试验参数，研究基因工程菌pGEX-ZjMT-B在处理重金属时的不同效果。根据实验数据，我们发现温度、PH值、填料等因素对重金属的去除效果都有一定的差异，在碱性比较强的水处理环境中，重金属离子的去除效果较好，比如在PH=9或11的条件下，Cd、 Cr、 Ni的去除效果要比在PH=4、 7的条件下，去除效果好，最究其原因，主要是由于重金属的金属特性所决定的，在碱性条件下，部分离子可能会以沉淀的形式去除。此外从实验数据还可以看出，在一定范围内，温度越高，重金属的去除率越高，分析其原因主要是由于温度直接影响着微生物的活性，从而进一步影响重金属离子。