第一章 绪论
上世纪七十年代初，我国科技工作者发明了维生素 C 二步发酵法，获得了国家发明二等奖并很快在全国推广使用。该法很大程度上简化了莱氏法的生产程序，并使产品生产成本降低，转化率提高[10]，因此得到了国内外维生素C 生产厂家的大力推广。在这一过程中，G. oxydans 转化 D-山梨醇为 L-山梨糖，L-山梨糖转变为 2-KLG 的过程是由一个混菌系统完成的，这一混菌发酵系统由普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)组成。其中K. vulgare为产酸菌，是一种典型的革兰氏阴性细菌，在发酵过程中将 L-山梨糖转化为2-KLG，K. vulgare 在单独培养时生长缓慢，几乎不产酸；B. megaterium 为伴生菌，是一种典型的革兰氏阳性细菌，在 L-山梨糖向 2-KLG 的转化过程中不直接参与相关酶的催化反应过程，但能在混菌体系中显著促进K. vulgare生长和2-KLG的积累[5, 9, 11, 12]。如果将混菌体系中的B. megaterium移除，产酸菌K. vulgare 的生长速率会显著下降，同时几乎不再具有合成2-KLG的能力。反之，在2-KLG的发酵中，K. vulgare的存在也对B. megaterium的生长具有显著的促进作用[13]。我国的研究人员对二步发酵法的研究工作从未间断，在过去的 20 多年中已经在两菌关系、培养基优化、细胞融合、生态调节等方面进行了大量的工作，进一步提高了二步发酵法的工艺稳定性以及2-KLG 的产量和产率[14-18]。
..........
第二章 2-KLG合成关键基因的克隆与鉴定
2.1 前言
K. vulgare 具有很高的将 L-山梨糖转化为 2-KLG 的能力，已经证实在 K. vulgare 中不只存在一个SDH和SNDH，也正是多个SDH和SNDH的共同作用使得K. vulgare具有很高的转化能力。在不同菌株中SDH和SNDH的辅酶不尽相同，这些脱氢酶的鉴定对于构建高效生产 2-KLG 的一步发酵工程菌是至关重要的。本研究中所涉及到的维生素C工业生产菌株K. vulgare WSH-001及B. megaterium WSH-002均已在本研究室的前期研究中完成全基因组测序，并进行了初步注释。本章首先对已测序的基因组进行更为深入的开放读码框(Open reading frame，ORF)预测和注释，并将预测的ORF在 NCBI、KEGG 和 BRENDA 等数据库中进行检索，寻找与已知功能蛋白序列具有较高同源性的ORF。根据对基因组的注释信息找出与 L-山梨糖合成 2-KLG 代谢途径相关的所有脱氢酶，并将这些脱氢酶在大肠杆菌中进行表达，将蛋白纯化后进行一系列脱氢酶的酶学性质分析，并结合亲/疏水性分析及跨膜结构预测，确定其在细胞中的功能与定位。为后续一步发酵生产2-KLG重组菌株的构建奠定基础。
2.2 材料与方法
质粒小量提取试剂盒、基因组提取试剂盒、溶菌酶、异丙基-D-硫代半乳糖(IPTG)、氨苄青霉素、卡那霉素、Taq DNA 聚合酶均购自上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、限制性内切酶、连接酶 solution I、Primer star DNA 聚合酶、大肠杆菌感受态制备试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DNA柱回收试剂盒、琼脂糖均购自购自大连宝生物工程有限公司；吩嗪硫酸甲酯(PMS)、2,6-二氯靛酚(2,6-DCIP)及 PQQ 购自上海Sigma-Aldrich 公司；SDS-PAGE 试剂盒、蛋白质标准分子量购自碧云天生物技术研究所；蛋白胨和酵母粉购自OXIOD公司。LB 培养基：10 g•L–1胰蛋白胨，5 g•L–1酵母粉，10 g•L–1 NaCl，pH7.4。筛选 E. coli JM109 转化子时，培养基中添加 100 μg•mL–1氨苄青霉素或者50 μg•mL–1卡那霉素； TB 培养基：12 g•L–1胰蛋白胨、24 g•L–1酵母粉、4 mL甘油、2.31 g•L–1 KH2PO4、12.54 g•L–1 K2HPO4，pH 7.0，进行重组菌诱导表达时培养基中添加50 μg•mL–1卡那霉素； 山梨糖培养基：20 g•L–1山梨糖，3 g•L–1酵母膏，10 g•L–1蛋白胨，3 g•L–1牛肉膏，1.5 g•L–1玉米浆，1 g•L–1尿素，1 g•L–1碳酸钙，0.2 g•L–1硫酸镁，1 g•L–1磷酸二氢钾，pH 6.7-7.0。
第三章 分子改造大肠杆菌一步发酵生产2-KLG ................... 29
3.1 前言 ........................ 29
3.2 材料方法 ...................... 29
3.3 结果与讨论 .................... 30
第四章 氧化葡萄糖酸杆菌全基因组测序及基因操作系统的构建 .................................... 37
4.1 前言 ................... 37
4.2 材料方法 ............ 37
第五章 氧化葡萄糖酸杆菌工程菌的构建及利用连接肽工程与辅因子工程对一步工程菌的改造 ................ 47
5.1 前言 ................... 47
5.2 材料方法 .................... 47
第六章 基于耐热交联蛋白CutA对氧化葡萄糖酸杆菌一步工程菌的改造
6.1 前言
耐热交联蛋白 CutA 来源于最适生长温度为 95-105℃的掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)，该蛋白的变性温度为 150℃，以三聚体的形式存在，可以作为蛋白支架提高蛋白稳定性[137]。本章首先将最佳组合的脱氢酶基因k0203和k0095 进行了密码子优化，然后将优化后的脱氢酶基因与 CutA 共表达，以 CutA 作为蛋白支架来提高酶的稳定性及催化效率，以期最终获得2-KLG产量的提高。在第五章中通过辅酶PQQ的过量表达有效提高了 2-KLG的产量，本章同样在以CutA作为蛋白支架构建的 G. oxydans 一步工程菌的基础上对PQQ进行表达，通过增加辅酶供给进一步提高2-KLG产量。
6.2 材料方法
以 SH3 和 SH3lig作为对接蛋白进行基于 CutA 一步工程菌的构建[138]，首先将 SH3及 SH3lig-(GGGGS)2-cutA 进 行 密 码 子 优 化 后 合 成 ， 再 将 优 化 后 的 SH3 与k0203-GGGGS-k0095 融合，将 SH3lig-(GGGGS)2-cutA 与 tufB 启动子融合，得到的SH3-k0203-GGGGS-k0095 与 tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA 经过酶切插入到 pGUC-tufB 的KpnI/BamHI 和 BamHI/XbaI 位 点 ， 获 得 重 组 表 达 质 粒pGUC-tufB-SH3-k0203-GGGGS-k0095-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA，电转到 G. oxydans WSH-003 中得到一步工程菌，简写为 G. oxydans/pGUC-tufB-k0203-GS-k0095-cutA。
...............
主要结论与展望
主要结论
(1)根据 K. vulgare WSH-001 基因组的初步注释，对 ORF 进行了进一步的预测和注释，最终得到与 L-山梨糖合成 2-KLG 代谢途径相关的关键酶，包括 KVU_1366、KVU_0203、KVU_2159、KVU_2142、KVU_PA0245、KVU_0095 及 KVU_PB0115。为了验证7个预测关键酶的酶学性质，将其分别在 E. coli 中进行了表达与纯化。测定酶活发现7个脱氢酶均为PQQ依赖性的酶，KVU_1366、KVU_0203、KVU_2142、KVU_2159及 KVU_PA0245 同时具有 SDH 及 SNDH 的活性，其中 KVU_2142 具有最高的比酶活为9.68 U/mg，为其它酶的3-10倍。而KVU_PB0115及KVU_0095 仅具有SNDH活性，后者为前者比酶活的近两倍，且均远高于以上 5 个 SDH/SNDH 的 SNDH 活性。进一步测定酶的动力学参数发现，在5个SDH/SNDH及2个SNDH中KVU_2142及KVU_0095理论上具有最高的底物结合能力，与酶活测定结果基本一致。体外催化能力的测定表明，将酶液与PQQ孵育5 min形成全酶后，L-山梨糖可以被转化为2-KLG。对5个SDH/SNDH单独及将其分别与 SNDH 组合后催化 L-山梨糖生成 2-KLG 的能力进行测定发现，5 个SDH/SNDH 单独及分别与 2 个 SNDH 组合催化 L-山梨糖均有 2-KLG 生成，其中KVU_2142 与 KVU_0095 组合生成浓度最高的 2-KLG 为 19.7 g•L–1。
展望
(1) 有研究表明，将不影响菌体生长与代谢的膜结合蛋白进行敲除以后，可以为外源表达的膜结合蛋白提供更多的空间，从而提高目标产物浓度。G. oxydans WSH-003 基因组信息显示该菌具有大量的膜结合蛋白，敲除部分不重要的膜结合蛋白可能会增加SDH/SNDH 及 SNDH 的表达量进而提高 2-KLG 产量。 (2) 本研究获得了一株最高可产 42.6 g•L–1的2-KLG一步工程菌株，但是在上罐发酵中分别采用与摇瓶相同的培养条件及控制较佳pH值的条件下均未得到2-KLG产量的提高。G. oxydans 为好氧菌，充足的供氧可以使菌体呼吸旺盛保持较快的生长速率，但是溶氧浓度过高时会产生羟自由基，超氧根负离子等活性氧破坏细胞组分影响细胞代谢，同时易导致代谢分流，不同阶段菌体的耗氧量不同，所以研究溶氧的控制对发酵的影响具有重要意义。通过不同阶段溶氧控制可能会有效提高2-KLG 产量。
........
参考文献（略）