本文是一篇药学论文，本文以培养鹿茸干细胞，获得其分泌物作为研究对象，以大鼠骨髓间充质干细胞和骨髓单核细胞为模型，初步研究了ASC-CM对其他动物细胞的成骨、破骨能力。
第一章 鹿茸的生物学研究进展
1.鹿茸再生的相关研究进展
鹿茸的再生是在角柄上进行的，角柄是着生于鹿头部的永久性骨桩。每年春天，由于鹿体内雄激素水平的快速下降导致完全骨化的鹿茸（即鹿角）从角柄上脱落，从而激活了鹿茸的再生；每年6月左右，再生的鹿茸就会进入到快速生长期，生长速度可达2 cm/天，且不发生病变。70余天可生成十几千克甚至几十千克重的鹿茸组织；夏末，鹿茸生长速度减慢并出现骨化；秋初，由于鹿体内雄激素水平的稳步上升导致鹿茸完全骨化、死亡，变成鹿角；鹿角于第二年春天再次从角柄上脱落，从而激活新一轮的鹿茸再生[3, 4]。
研究发现，鹿茸的再生是一个依赖于干细胞的过程，鹿茸干细胞位于角柄断端的骨膜（PP）组织中[5]。鹿茸干细胞表达胚胎干细胞和间充质干细胞的标志物，具有自我更新能力，能够在离体情况下分化成多种成体细胞类型[6]。与其他具有附属器官再生能力的低等模式动物一样，鹿茸能够实现再生，也必须在角柄断端先发育一个锥形的组织体，即再生芽基[7]。虽然已知鹿茸再生芽基由激活的鹿茸干细胞形成，但其形成的分子机制尚不清楚。鹿茸芽基形成的同时伴随着角柄断端伤口的愈合，近10 cm直径的伤口可在一周内完全闭合，几乎不留伤疤，属于再生性愈合。研究发现这种愈合完全依赖于PP组织的存在[8]，但PP组织诱导再生性皮肤伤口愈合的机制尚未得到完全解析。鹿茸生长初期，芽基细胞的快速分裂、分化形成鹿茸的生长中心，该中心由四层组织构成：间充质（RM）、前软骨（PC）、过渡区（TC）和软骨（CA）组织[9]。有研究发现，鹿茸出现前所未有的生长速度，是RM细胞的快速分裂导致的。鹿茸的超速生长总是发生在鹿体内胰岛素样生长因子1（IGF1）的高峰期；鹿茸生长中心组织特异高度表达IGF1的受体[10]；离体情况下IGF1可显著刺激RM细胞的分裂，并呈量效关系；因此IGF1被称为鹿茸生长刺激素。鹿茸是一个通过软骨内成骨方式生成的骨质器官，RM细胞在高速分裂的同时，部分细胞也开始出现分化，首先分化成前成软骨细胞，其后成熟为成软骨细胞和软骨细胞，从而形成软骨组织，软骨组织最终由骨组织替换。与正常的体软骨不同，鹿茸软骨具有管状化的特点，推测管状化软骨可能是鹿茸超速生长所必需的[11]。鹿茸生长期，鹿体外周血睾酮处于低水平，构成了破骨内分泌环境。有的鹿骨骼在短短的2个月内，损失的骨量可达30% 。
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2.鹿茸成骨的影响因素
2.1体内相关激素
鹿体内睾酮含量的变化对茸角发生、生长、骨化、脱皮和脱落起着决定性作用[18]，在完全骨化的鹿角脱落、新茸发生以及鹿茸的快速生长时期，鹿体内血清中的睾酮含量最低；在鹿茸骨化和茸皮脱落时期，鹿体内睾酮的含量逐渐上升，并且上升过程一直持续到交配季节，此时鹿体内睾酮含量达到峰值。Bartos[19]等发现，多个鹿种的鹿茸的发生与再生总是伴随着睾酮含量的季节性变化。Price[20]等研认为睾酮可以诱导鹿茸尖端细胞增殖以及分化的作用；Rolf[21]等通过实验表明，用高浓度的雄性激素（睾酮以及二氢睾酮）刺激鹿茸细胞，可以使其达到增殖的效果。但Li[22]等认为睾酮必须与IGF-1相互作用后，才具有刺激 成骨阶段鹿茸细胞增殖的作用。
除睾酮外，甲状腺素(T3,T4)和甲状腺旁素(PTH)也有可能参与鹿茸成骨过程。Bubenik[23]等，以白尾鹿的生长期鹿茸血、颈静脉血以及大隐静脉血中T3的变化，研究表明，在生长期鹿茸血中T3含量较颈静脉血以及大隐静脉血中的T3含量低，表明T3也是鹿茸的成骨过程中的一种调控因子，而不同鹿茸的生长强度其T3的利用程度也是不同的。由于现季节性变化，T4的水平在鹿茸发生与再生过程中有着不同的变化趋势，且在秋天含量升高，因此推定T4在鹿茸发生、再生以及生长过程中具有一定的作用。此外[24]，位于鹿茸生长中心的许多细胞均高度表达PTH 受体，而PTH主要作用于骨质吸收过程，因此，PTH 可能在鹿茸破骨细胞吸收骨基质过程中具有重要的调节作用。鹿茸生长过程中要利用Ｔ3其利用比率与鹿茸生长强度有关。而 Ｔ4在茸骨中不被利用。
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第二章 鹿茸化学成分对骨代谢影响的研究进展
1.鹿茸多肽对骨代谢的研究
鹿茸多肽具有抗炎、抗衰老、促进创伤愈合、增强免疫力等的作用。酶解得到的鹿茸多肽表明，鹿茸多肽成分能够显著促进软骨细胞和成骨细胞的增殖。成骨细胞的分化及成熟的标志产物为碱性磷酸酶( ALP) ，蔡明军[34]等将鹿茸多肽分离纯化为分子量小于800μ的小肽并且进行培养，实验发现，这些小肽不仅可以促进人成骨肉瘤细胞(OS-732)的分化，还能提高ALP的表达，所以鹿茸多肽具有成骨作用。李荣俊[35]对大鼠细胞进行离体培养，并使用不同浓度的鹿茸多肽进行干预，发现浓度为400μg/mL的实验组，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的表达量最高；所以，鹿茸多肽可能是通过上调 BMP 基因表达量来促进成骨发生的。
1.1鹿茸多肽对软骨细胞的影响
鹿茸多肽对骨及成骨细胞DNA的合成也有一定的促进作用。张志平[36]通过体外实验证实了鹿茸多肽不仅可以促进软骨细胞的增殖并且还能促进正常软骨细胞及凋亡软骨细胞的蛋白多糖合成，还能促进凋亡软骨细胞合成代谢功能。上述研究表明，鹿茸多肽可以促进软骨细胞的增殖。此外，鹿茸多肽还能延缓软骨细胞在体外培养过程中的增殖衰老的趋势。β半乳糖苷酶与软骨细胞老化相关[37]，鹿茸多肽可以抑制其表达、同时鹿茸多肽还能促进软骨细胞的增殖以及表型、减少软骨细胞G1期的细胞含量等，还能抑制软骨细胞的老化。鹿茸多肽促进凋亡状态下软骨细胞合成代谢功能，Caspase-3mRNA表达逐渐上升,Caspase-3蛋白酶活性逐渐增强,表明Caspase-3参与细胞凋亡并起着重要作用并起着重要作用。鹿茸多肽通过下调Caspase-3 mRNA的相对表达来抑制其蛋白酶的活性,从而阻止或逆转软骨细胞凋亡，此外，鹿茸多肽还可以增强细胞对凋亡诱导剂的抵抗能力。
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2.鹿茸多糖对骨代谢的研究
在成骨细胞增殖时期，成骨细胞分泌 BALP，BALP 同ALP一样是反映成骨细胞功能的重要指标之一。ELISA实验证明，鹿茸多糖和鹿茸多肽均可明显上调去卵巢骨质疏松模型大鼠血清中成骨细胞的标志产物，促进ALP、E2、OT、BMP-2等活性，抑制破骨标志TRAP的活性。qP CR验证了鹿茸多糖多肽联用可以显著上调去卵巢骨质疏松模型大鼠骨组织中成骨细胞基因BALP, OT, BMP-2, Smad1, Smad5, Runx2相对表达水平[44]，且鹿茸多肽的作用要优于鹿茸多糖的作用，这种情况可能与鹿茸多肽在鹿茸中含量要高于鹿茸多糖有关。鹿茸多糖具有预防绝经后骨质疏松的发生的作用，鹿茸多糖多肽联合给药结果表明，鹿茸多肽、鹿茸多糖单独给药作用要低于鹿茸多肽多糖的联合给药，而鹿茸多肽作用优于鹿茸多糖。鹿茸多糖、多肽不同指标基因及蛋白的影响不同，因此，鹿茸多肽多糖联合给药可产生协同增效的结果。
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第三章 鹿茸干细胞分泌物抑制大鼠单核细胞破骨分化 ................. 32
3.1 实验材料 .................................... 33
3.2 实验方法 .................................... 33
3.3 实验结果 .............................. 35
第四章 鹿茸干细胞分泌物(ASC-CM)对骨质疏松模型大鼠的影响 ................................. 37
4.1 实验材料 ........................... 37
4.2 实验方法 ................................. 38
4.3 实验结果 ..................................... 40
结论 ........................ 45
第四章 鹿茸干细胞分泌物（ASC-CM）对骨质疏松模型大鼠的影响
4.1 实验材料
4.1.1实验动物
成年SD大鼠24只（雌性，200g-220g，SPF级），饲养温度20-25°C，空气相对湿度40%-70%；洁净度7级，昼夜交替照明，自由进食与饮水（批准号IASPT201907）。
4.1.2实验仪器
其中部分实验仪器与2.1.1相同，其他仪器见表4-1
药学论文参考
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结论
本文以培养鹿茸干细胞，获得其分泌物作为研究对象，以大鼠骨髓间充质干细胞和骨髓单核细胞为模型，初步研究了ASC-CM对其他动物细胞的成骨、破骨能力。主要作用如下：
通过离体培养鹿茸干细胞，可以获得鹿茸干细胞分泌物，经过0.22μm滤膜过滤后，可用于后续实验，且并未发现其存在安全性问题。
ASC-CM可以促进大鼠BMSC增殖能力
ASC-CM可以促进通过成骨诱导培养基诱导21天的大鼠BMSC的成骨分化能力，通过茜素红、ALP染色以及对相关成骨基因BSP、COL-I、OCN、OPN以及RUNX-2的mR NA相对表达量的检测，可以得出ASC-CM促进大鼠BMSC的成骨能力优于h BMSC-CM。
ASC-CM可以抑制大鼠BMMs聚集形成破骨细胞，说明了ASC-CM具有抑制破骨的能力，且抑制能力高于hB MSC-CM。
ASC-CM可以对OP模型大鼠有明显的作用效果，说明了ASC-CM在除了鹿的其他动物体内，也可以有效的改变或治疗OP的发生。
参考文献（略）