本文是一篇药学论文，本文首先建立了抑菌圈初筛、TLC半定量和HPLC定量的多种检测方法。从实验室保藏的FK506产生菌株SIPI-FK-006出发，通过自然筛选得到一株FK506效价为671 mg/L的菌株SIPI-FK-6-S-28。对该菌株进行16SrRNA测序，初步鉴定其为筑波链霉菌。
第一章绪论
1.1引言
器官移植是目前重要的临床医学治疗手段之一。中国每年需要器官移植的患者数量约30万。从2015年至今，中国的器官捐献、移植数量均居世界第二位。2022年仅前10个月，完成器官移植的手术数量为17141例，其中肝移植5123例，肾脏移植10734例。在器官移植的过程中，使用免疫抑制剂可以有效减少器官移植过程中排异反应发生率，保持移植物长期存活[1]。常用的免疫抑制剂根据其性质可以分为以下五类：糖皮质激素类、微生物代谢产物、抗代谢物、多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体、烷化剂类。
FK506又称他克莫司，属于微生物代谢产物类免疫抑制剂，主要由链霉菌发酵获得。与其同类型的环孢菌素（ciclosporin，CsA）相比，FK506药理活性强100倍，且同时具有用药剂量低、排异反应发生率低等特点[2]。FK506自1994年被FDA批准用于肝移植手术治疗，目前已经成为临床上器官移植的一线用药。2021年7月FDA又批准其用于儿童的肺移植器官排斥反应，同时也是我国首个获批的儿童器官移植免疫抑制剂。
..........................
1.2 FK506简介
1.2.1 FK506发现及结构特征
1982年，日本藤泽公司（Fujisawa Pharmaceutical）测试了各种种类的链霉菌发酵液对淋巴细胞的抑制作用，企图筛选得到一种新的微生物来源免疫抑制剂；1984年，FR900506（FK506）从筑波链霉菌（Streptomyces tsukubaensis）中被分离。由于FK506表现出较CsA更为优秀的药理作用活性，一经面世便受到广泛关注。1992年藤泽制药推出一种以FK506为活性成分的口服免疫抑制剂，商品名为Prograf。1994年FDA批准FK506用于预防肝移植后免疫排斥反应[3]。此后，FK506的适应症扩大到各类器官移植排斥反应、特异性皮炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性眼病等。
FK506是一种大环内酯类抗生素，又名他克莫司，分子式为C44H69NO12，其化学结构为两个酮，一个二十三元大环内酯(或酯)，一个酰胺，一个乙烯基，两个三取代烯烃，一个半甲酮，三个O-甲基，和五个C-甲基，其余是12个亚甲基和13个甲基[4]。FK506主要的副产物包括FK520、FK506D，它们的主要区别在于FK506的C-21烯丙基侧链被FK520中的乙基和FK506D中的丙基取代（图1.1）。
药学论文怎么写
.............................
第二章FK506高产菌株的选育
2.1实验材料
2.1.1菌株
SIPI-FK006（本实验室保藏）。
野生酿酒酵母（从葡萄表面分离）。
2.1.2材料与试剂
本实验所用的材料及试剂见表2.1。
药学论文参考
...............................
2.2实验方法
2.2.1培养条件
2.2.1.1平板种子培养
平板置于28℃恒温培养，传代周期5~7d，接种周期5~10d，视菌株生长状态决定。
2.2.1.2种子培养
刮取平板上生长的菌株孢子约2 cm2，置于种子培养基中，种子摇瓶装量为30 ml/250 ml，培养温度28℃，摇床转速240 rpm，培养时间48 h。
2.2.1.3发酵培养
将培养好的种子液按12%的接种量转接至发酵培养基中，发酵培养基摇瓶装量30 ml/250 ml，培养温度25℃，摇床转速220 rpm，培养时间9 d。
2.2.2抑菌圈筛选的建立
从葡萄表面分离得到一株野生酿酒酵母，刮取适量菌株在1 ml无菌水中混合均匀，将其加入灭菌后冷却至45℃左右的PDA培养基中，混合均匀，倒入平板中，冷却凝固，待用。使用多种方法分离FK506生产菌株单菌落，在平板上划线培养，用直径0.6 cm的打孔器取新鲜培养好的FK506生产菌株平板，垂直置于含有酿酒酵母的PDA培养基上，28℃培养过夜，用游标卡尺量取抑菌圈大小。将上述分离出的菌株进行摇瓶发酵，通过HPLC检测，对照抑菌圈大小，验证抑菌圈筛选的可信度。
2.2.3 TLC法检测发酵液中FK506的含量
样品制备：取1 ml发酵液离心，去除上清，加500μl丙酮混合均匀，超声30 min，12000 rpm离心10 min。
尝试不同的溶剂体系与比例，得到FK506样品点清晰、分离度好、Rf值合适的展开剂体系。
..............................
第三章 影响种子及发酵稳定性的因素研究 ....................... 29
3.1 实验材料 ..................................... 29
3.1.1 实验菌种 ................................... 29
3.1.2 材料与试剂 ............................ 29
第四章 消泡剂对菌株发酵过程的影响 ............................ 39
4.1 实验材料 ............................... 39
4.1.1 实验菌种 ............................... 39
4.1.2 材料与试剂 ..................................... 39
第五章 发酵工艺优化 .............................. 51
5.1 实验材料 .......................................... 51
5.1.1 实验菌种 ............................... 51
5.1.2 材料与试剂 ................................... 51
第六章发酵罐工艺优化
6.2实验方法
6.2.1种子培养方法
二级种子装量70/750 ml，培养方法按照5.3.3.4中优化的方法进行培养。
6.2.2分析方法
每24 h取样一次，HPLC分析方法同第二章
6.2.3发酵罐参数控制
发酵参数控制如表6.1所示。
药学论文参考
.....................................
全文总结
（1）从实验室保藏的FK506产生菌株SIPI-FK-006出发，建立了抑菌圈初筛、TLC半定量和HPLC定量的多种检测方法。通过自然筛选得到一株FK506产量为671 mg/L的菌株SIPI-FK-6-S-28。对该菌株进行16SrRNA测序，初步鉴定其为筑波链霉菌。
（2）对菌株SIPI-FK-6-S-28进行紫外诱变、NTG诱变、高糖平板筛选、高盐平板筛选、前体抗性筛选和核糖体工程等一系列选育，得到一株产量提升53.6%的菌株SIPI-FK-ST-18，效价为1030.9 mg/L，选择该菌株作为后续的实验菌株。
（3）为解决高产菌株在平板种子培养及发酵过程中生长及产FK506不稳定的问题。根据文献调研及前期实验，对影响平板种子、发酵等培养过程中稳定性的因素进行考察。结果发现，在平板种子培养方面，平板中添加高浓度葡萄糖对平板种子稳定性没有影响；添加双氧水刺激菌株产生氧化应激孢子可以提高平板种子稳定性并促进FK506合成；用高浓度涂布平板的方法传代可以提高平板孢子分布的均匀性和稳定性；平板中添加25µg/ml链霉素可以提高平板种子的传代稳定性；平板在28℃下保存的稳定性优于4℃。另外，在发酵培养方面，发酵培养基中添加消泡剂可以提高发酵摇瓶产FK506的稳定性和产量。
（4）探究了消泡剂对筑波链霉菌发酵的影响。有机硅类、聚醚类、聚乙烯醇类消泡剂对FK506效价都有促进作用，其中有机硅类的促进效果最为显著；消泡剂最佳添加量为2%；最佳添加时间为发酵培养的第4 d。消泡剂的添加除了提高发酵全过程FK506的生物合成外，还有利于维持发酵后期菌丝的形态完整，改善前期溶氧。对糖、脂肪酸代谢的影响方面，消泡剂组的糖、脂肪酸代谢都更加活跃，并且消泡剂组在前期积累更多的三酰甘油。
参考文献（略）