本文是一篇药学论文，笔者通过qRT-PCR技术分析了红曲霉菌GST基因在不同生长阶段的表达情况，并分析了双氧水胁迫、底物胁迫、金属离子胁迫及低温和高温胁迫对红曲霉菌GST基因表达的影响。
第一章 绪论
1.1 红曲霉菌
红曲霉菌(Monascus)及其发酵产物在我国的生产和使用已经有1000多年历史，《本草纲目》记载:“红曲主治消食活血，健脾燥胃[1]，红曲霉菌丰富的代谢产物，包括红曲色素、洛伐他汀[2]、红曲多糖、酶类等，被广泛应用于食品及医药领域。
1.1.1 洛伐他汀
日本教授Akira Endo首先从红曲霉菌中分离出一种能够抑制胆固醇合成的活性物质，称为莫那可林K（Monacolin K，MK），MK用于治疗高胆固醇症，能阻止动脉硬化发展，减少心肌梗塞等的发病危险[3, 4]。MK是一种白色针状晶体，在水中溶解度低，但在有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿中溶解度高。MK有酸型或内酯型两种形态（图1.1），其中内酯型MK在人体会转化为酸式结构发挥药理作用。
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1.2 真菌谷胱甘肽S-转移酶
谷胱甘肽S-转移酶是一种古老的多功能酶，通常参与有毒化合物的分解代谢、应激反应以及细胞发育、转运和代谢等[31]。序列分析是GST分类的主要依据，如果序列同一性大于40%，它们被视为属于同一类，而如果同一性小于25%，它们被认为属于不同的类别[32]。真菌GST主要被分为八个不同的类别，分别是GTT1、GTT2、MAK16、GHR、Omega、eE F1Bγ、Ure2p和GSTFuA [31]。然而，仅根据序列标准，出现了许多“非标准”的GST，例如eE F1Bγ，MAK16，增加了GST分类的复杂性。
1.2.1 Ure2p类
Ure2p类GST仅在真菌和细菌中发现，在酿酒酵母中，Ure2p既作为氮分解代谢抑制的调节剂，又作为应激反应蛋白[33]。通过对真菌Ure2p类GST进行序列分析发现可以将其分为Ure2pA和Ure2pB两个类，其中Ure2pA类是真菌特异性的，其基因数量在物种之间是高度可变的。腐生真菌的Ure2pA类GST基因数量比子囊菌的多，并且Ure2p类在伞菌纲中的扩张和多样性可能与环境条件有关[31]。
虽然Ure2pA类是真菌特异性的，但已发现的Ure2pB类GST序列与细菌序列具有同源性，担子菌Phanerochaete chrysosporium的PcUre2pB1具有与细菌EcY fcG和EcY ghU相同的生化和结构特征，特别是存在两个谷胱甘肽结合位点、对GSSG的高亲和力和二硫还原酶活性[34]。与Ure2pB相比，Ure2pA具有经典的转移酶活性、更分散的催化位点和更高的结构灵活性。
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第二章 红曲霉菌GST基因克隆及生物信息学分析
2.1 实验材料与方法
2.1.1 菌株与培养基
红曲霉菌菌株M. purpureus h2019保存于本实验室（成都大学，四川抗菌素工业研究所），大肠杆菌Trans1-T1感购自全式金生物科技有限公司（成都）。
本研究所用培养基如下： PDA培养基（g/L）：马铃薯葡萄糖琼脂10g。
红曲霉菌活化培养基（g/L）：葡萄糖20 g、酵母提取物3 g、蛋白胨10 g、磷酸二氢钾2.5g、磷酸氢二钾1g、无水硫酸镁1g、硫酸亚铁10 mg。
红曲霉菌发酵培养基（g/L）：葡萄糖50 g 、酵母提取物3 g、蛋白胨10 g、磷酸二氢钾2.5g、磷酸氢二钾1g、无水硫酸镁1g、硫酸亚铁10 mg。
LB培养基（g/L）：蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，氯化钠10g。
2.1.2 试剂及仪器
（1）试剂盒
真菌基因组DNA提取试剂盒，真菌 RNA提取试剂盒，购自天根生物技术公司（成都），pEASY-T3载体购自全式金生物科技有限公司（成都），金牌Mix PCR试剂，2×T5 Mix PCR 试剂，DNA凝胶回收试剂盒，高纯度质粒提取试剂盒，购自擎科生物科技有限公司，反转录试剂盒购自庒盟生物科技有限公司（成都）
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2.2 结果与讨论
2.2.1 红曲霉菌菌株的分子鉴定
M. purpureus h2019为本实验室的保藏菌株，为进一步确定其分类学地位，本研究选取真菌核糖体基因转录间隔区( ITS)序列分析法进行进一步红曲霉菌种、属的分子鉴定。以红曲霉菌基因组DNA为模板，ITS1、ITS4为引物，扩增得到约550bp的片段（图2.1b），经测序比对及进化树分析，M. purpureus h2019与 M. purpureus NRRL 1596支持率高达94%（图2.1c），验证了M. purpureus h2019的分类学地位。
2.2.2 红曲霉菌GST基因的鉴定
从红曲霉菌基因组中鉴定得到17个GST基因，保守结构域分析鉴定出三个Ure2p类GST和三个eEF1Bγ类GST，该两类所含的红曲霉菌GST成员共占比35.3%。另外GTT3、kappa、 Metaxin、Omega、Zeta和GTT1类均有一个红曲霉菌GST成员，MpGST4、MpGST6、MpGST10、MpGST14、MpGST15虽有GST典型结构域，但却无法归类于目前已知的亚家族，表明其可能属于新类别GST。
2.2.3 红曲霉菌GST基因克隆
试剂盒提取的红曲霉菌总RNA，条带清晰明亮，无降解现象（图2.2a）。以红曲霉菌cD NA为模板克隆得到的片段与红曲霉菌GST目的基因片段大小一致（图2.2b）。测序比对与挖掘得到的序列一致，表明红曲霉菌GST基因克隆成功。
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第三章 红曲霉菌GST基因表达模式研究 ....................... 33
3.1 实验材料与方法 ................................. 33
3.1.1 菌株与培养基 ....................................... 33
3.1.2 试剂及仪器 ..................................... 33
第四章 红曲霉菌GST基因的原核表达及酶学特性研究 ................... 47
4.1 材料与方法 .................................... 47
4.1.1 菌株、质粒与培养基 ........................ 47
4.1.2 试剂及仪器 .......................................... 47
全文总结 ............................ 65
第四章 红曲霉菌GST基因的原核表达及酶学特性研究
4.1 材料与方法
4.1.1 菌株、质粒与培养基
实验所用大肠杆菌E.coil 菌株 BL21、pEASY-T3载体购自全式金生物科技有限公司（成都），pMAL-c5e麦芽糖载体保存于本实验室。LB培养基同2.1.1。
4.1.2 试剂及仪器
（1）试剂盒
SDS-Page凝胶试剂盒购自庒盟生物科技有限公司（成都）。其它试剂盒同2.1.2。
（2）主要试剂及设备
本章所用试剂及仪器见表4.1，同上两章的不再赘述。
药学论文参考
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全文总结
（1）从紫色红曲霉菌基因组中鉴定得到一个含17个成员的GST基因家族，分属于多个不同的亚类，其中Ure2p和eE F1Bγ两个类所含的成员最多。
（2）以红曲霉菌的cD NA为模板成功克隆了红曲霉菌GST基因，利用生物信息学分析方对其进行了理化性质分析、序列分析及分子进化分析。结果表明红曲霉菌GST基因家族的不同成员在理化性质上存在差异，多数成员的分子量在25kDa左右，其中52.3%的成员属于稳定蛋白，47.1%的成员属于碱性蛋白。同属eE F1Bγ和Uer2p类的成员序列相似性高，表现出相似的基因结构和Mtotif结构，在进化过程中经历了很强的纯化选择。
（3）顺式元件及蛋白互作关系预测表明红曲霉菌GST基因可能参与到多种非生物胁迫响应过程。
（4）通过同源模建获得10个GST成员的三级结构高度保守，均为同源二聚体，并采用典型的GST折叠。
（5）表达模式分析结果表明：红曲霉菌GST的表达在不同生长时期呈现出显著差异，MpGST1的表达量高，MpGST7检测不到表达，多数成员的表达量较低。红曲霉菌代谢产物红曲色素、洛伐他汀及桔霉素的关键基因与红曲霉菌GST呈现出不同程度的正相关性。在0.5mM双氧水诱导下15个成员均出现不同程度的上调，HED诱导下所有成员均受到下调，其他底物诱导时红曲霉菌GST基因家族的部分成员有显著的上调，其中经典底物CDNB诱导时有7个基因显著上调，MpGST1的表达量可升至50倍以上。金属离子胁迫时所有成员均有不同程度的上调和下调，其中2mM的Zn2+处理下显著上调的基因数最多，多数成员在Fe3+、Ba2+胁迫下下调，同类的GST基因成员相关性不高。6个成员在响应低温胁迫时有显著上调，且MpGST17、MpGST11在低温和高温胁迫下均有高表达。
参考文献（略）